核誘變和鹽度馴化硅藻生長(zhǎng)富集油脂的機(jī)理研究.pdf

1、微藻吸收太陽(yáng)能以制備生物柴油等清潔能源對(duì)于解決當(dāng)前石油等化石能源的污染嚴(yán)重和日益短缺的危機(jī)與矛盾具有非常重要的意義。硅藻在生長(zhǎng)速度和油脂含量上具有很大的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，成為國(guó)內(nèi)外制取生物柴油的研究熱點(diǎn)。本文重點(diǎn)研究了核誘變和鹽度馴化硅藻生長(zhǎng)富集油脂的反應(yīng)過程，分析了藻種經(jīng)歷核誘變、鹽度脅迫以及缺氮缺硅前后的關(guān)鍵基因變化，揭示了硅藻生長(zhǎng)富集油脂的代謝通路調(diào)控機(jī)理。
　　本文以菱形藻Nitzschia sp.為主要研究對(duì)象，首先采用60Co

2、-γ射線核誘變和高鹽度馴化方法，提高了菱形藻生長(zhǎng)富集油脂能力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)核輻射劑量為900Gy時(shí)篩檢得到的菱形藻突變體的生物質(zhì)密度比野生藻種增加了53.8％，油脂干重產(chǎn)量提高了28.1％。對(duì)菱形藻突變體通過30‰高鹽度的梯度馴化，細(xì)胞內(nèi)油脂含量由11.8％提高到27.20％。當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)缺N和缺Si時(shí)，此突變優(yōu)勢(shì)藻株（Nitzschia ZJU1）的油脂含量提高到51.22％。針對(duì)藻株Nitzschia ZJU1進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序和不同

3、鹽度條件下細(xì)胞中基因表達(dá)圖譜的測(cè)定，并對(duì)參與脂肪酸和TAG的生物合成代謝途徑進(jìn)行了重建。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在海水培養(yǎng)藻Nitzschia ZJU1中，脯氨酸、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白酶體、谷胱甘肽、碳的固定、氮素代謝的通路均有較大差異。在脂類代謝相關(guān)的幾個(gè)通路中，乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)、β-酮脂酰-ACP合酶Ⅰ和Ⅱ和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)等關(guān)鍵基因的表達(dá)量有所上調(diào)。
　　本文利用137Cs-γ射線對(duì)經(jīng)60Co-γ射線誘變選育后

4、的高產(chǎn)油突變?cè)逯闚itzschia ZJU1進(jìn)行二次核輻射，利用尼羅紅熒光方法篩選獲得兩株單細(xì)胞的高產(chǎn)油突變?cè)逯闚itzschia ZJU2和Nitzschia ZJU3，其油脂產(chǎn)量相比于藻株NitzschiaZJU1由209.90 mg/L分別提高到245.52mg/L和311.60mg/L。利用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行藻Nitzschia sp.細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析了原始Nitzschia sp.藻株和通過兩次誘變后篩選出的具

5、有生長(zhǎng)快、產(chǎn)油高優(yōu)勢(shì)的藻株Nitzschia ZJU2與脂質(zhì)合成相關(guān)的代謝通路和基因表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞生長(zhǎng)、碳水化合物以及蛋白質(zhì)合成相關(guān)的9條代謝通路發(fā)生明顯變化;參與脂質(zhì)合成的相關(guān)基因，如ACCase、DGAT等關(guān)鍵基因的表達(dá)均有明顯上調(diào)，這些代謝通路的變化以及基因表達(dá)的上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)以及脂類的合成，提高了細(xì)胞的油脂產(chǎn)量。另外，通過單核苷酸多態(tài)性的分析發(fā)現(xiàn)藻株Nitzschia ZJU2中有40795個(gè)非同義突變，這也發(fā)映出核

6、輻射對(duì)于藻株突變的影響。
　　本文對(duì)二次誘變?cè)宸N通過培養(yǎng)基缺氮缺硅和加磷調(diào)控突變體生長(zhǎng)的油脂含量，將Nitzschia ZJU2和Nitzschia ZJU3的油脂含量由22.57％分別提高到55.21％和53.66％。并且其所制備的生物柴油多不飽和脂肪酸含量降低，熱值可達(dá)41.50MJ/kg。同時(shí)本文對(duì)缺N和缺Si培養(yǎng)條件下的藻株進(jìn)行基因表達(dá)譜的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)同時(shí)缺N和缺Si培養(yǎng)條件下有4，598個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)，3，063個(gè)基因表

7、達(dá)量上調(diào)，其中乙酰輔酶A羧化酶等許多與脂類合成相關(guān)的基因表達(dá)量顯著上調(diào)。
　　本文首次選用可調(diào)角度式的封閉式平板光生物反應(yīng)器（容積30L）對(duì)二次誘變?cè)逯闚itzschia ZJU2進(jìn)行中試實(shí)驗(yàn)。采用優(yōu)化培養(yǎng)基得到硅藻生物質(zhì)產(chǎn)量為1.73g/L，進(jìn)行缺氮缺硅脅迫調(diào)控使細(xì)胞油脂含量從17％提高到50％，提取油脂制取生物柴油的熱值達(dá)到40MJ/kg。說(shuō)明了二次誘變?cè)逯闚itzschia ZJU2具有生長(zhǎng)快和含油高的優(yōu)勢(shì)、以及良好的遺傳穩(wěn)