系列褐藻膠寡糖的制備及其抗氧化相關(guān)生物學(xué)活性（拮抗酒精性肝損傷及防治帕金森癥）研究.pdf

1、近年來，隨著海洋藥物研究的興起，海洋多糖及寡糖因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的生物學(xué)活性成為研究的熱點。海藻是重要的海洋生物資源，海藻多糖及寡糖因其來源廣泛，生物學(xué)活性多樣而備受關(guān)注。褐藻膠是來源于褐藻的一類聚陰離子性質(zhì)多糖，褐藻膠因其具有良好的凝膠性質(zhì)及組織相容性而廣泛應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)藥等多個領(lǐng)域，近年來，通過多種降解方法制備的褐藻膠寡糖顯示出諸多生理藥理學(xué)活性，逐漸成為各國學(xué)者所重視。
　　當(dāng)今日益惡化的環(huán)境污染，現(xiàn)代人緊張的生

2、活節(jié)奏和不健康的生活方式以及自身營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，極易誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激。大量研究表明氧化應(yīng)激與諸多人類重大疾病密切相關(guān)，如心腦血管疾病、癌癥、自身免疫性疾病、酒精性肝病、神經(jīng)退行性疾病等。近年來，臨床和基礎(chǔ)研究表明，一些具有抗氧化活性的化合物對氧化應(yīng)激相關(guān)疾病具有治療和改善的作用。褐藻膠寡糖具有良好的抗氧化活性，且具有天然無毒的優(yōu)點，故將其應(yīng)用氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的防治具有一定的可能性。此外，我國是世界上最大的褐藻膠生產(chǎn)國家，.提供超過總

3、產(chǎn)量70％的褐藻膠，因此無論是從藥物開發(fā)角度還是社會經(jīng)濟(jì)價值角度出發(fā)，對褐藻膠寡糖的高值化開發(fā)利用都具有重要的意義和價值。
　　基于以上原因，本論文旨在制備不同系列褐藻膠寡糖，較為系統(tǒng)地研究其抗氧化活性及其在抗氧化相關(guān)藥學(xué)活性中的應(yīng)用，主要內(nèi)容如下:
　　1.系列褐藻膠寡糖的制備及結(jié)構(gòu)表征。建立了酸降解、氧化降解、酶解寡糖超濾分級法制備不同重均分子量系列褐藻膠寡糖的工藝，首次采用微波降解法，在不加入酸催化的條件下實現(xiàn)對褐藻膠

4、的可控降解，制備獲得不同分子量的系列褐藻膠寡糖。運(yùn)用紫外、紅外、核磁、質(zhì)譜等手段對四種方法所得寡糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。結(jié)果表明不同降解方法所制備的褐藻膠寡糖存在結(jié)構(gòu)差異:采用酸降解法和微波降解法所得寡糖為保持其天然結(jié)構(gòu)的飽和褐藻膠寡糖;采用氧化降解法所制備的寡糖為還原端糖環(huán)開環(huán)，C1被氧化成羧基結(jié)構(gòu)的寡糖;采用酶解超濾分級法所得寡糖為在寡糖非還原端糖環(huán)C4、C5形成不飽和雙鍵的寡糖。最終獲得了22個不同重均分子量、不同結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)的兩大系列褐藻膠

5、寡糖（系列甘露糖醛酸寡糖和系列古羅糖醛酸寡糖）及15個飽和褐藻寡糖單體。為褐藻膠寡糖生物學(xué)活性及其構(gòu)效關(guān)系研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，與傳統(tǒng)酸降解相比，采用微波加熱法制備低聚合度褐藻膠寡糖具有高效清潔，后處理簡單（無需除鹽），產(chǎn)率高（80％以上）等優(yōu)點，可以將其作為制備褐藻膠寡糖及標(biāo)準(zhǔn)品的手段之一。
　　2.對系列褐藻膠寡糖組分及飽和褐藻膠寡糖單體進(jìn)行了較為系統(tǒng)的體外抗氧化活性對比研究。本文從自由基清除(DPPH、超氧自由基)和亞鐵

6、離子絡(luò)合兩方面對其抗氧化活性進(jìn)行評價。實驗結(jié)果表明分子量（聚合度）、單糖組成和端基糖環(huán)結(jié)構(gòu)差異對系列褐藻寡糖的抗氧化活性均具有一定的影響。具體表現(xiàn)為:①寡糖聚合度越小其抗氧化活性越強(qiáng);單糖在各項指標(biāo)中均顯示出優(yōu)越的抗氧化活性。②端基糖環(huán)結(jié)構(gòu)不同的寡糖組分，其抗氧化活性不同:對DPPH和超氧自由基的清除力，飽和褐藻膠寡糖的活性較好，故推測糖環(huán)端基結(jié)構(gòu)的改變會影響寡糖供氫力;還原端1-羧基的寡糖具有最強(qiáng)的Fe2+絡(luò)合力，這與其多酸結(jié)構(gòu)有關(guān)。

7、③單糖組成(M/G)對寡糖抗氧化活性也具有一定的影響。對超氧自由基清除活性，飽和M寡糖活性高于飽和G寡糖，還原端1-羧基結(jié)構(gòu)的寡糖則與之相反，即G寡糖活性優(yōu)于M寡糖;對亞鐵離子的絡(luò)合作用方面，G系列寡糖均強(qiáng)于相應(yīng)結(jié)構(gòu)及分子量段的M系列寡糖，這與G寡糖可與金屬離子形成穩(wěn)定的“蛋殼箱”結(jié)構(gòu)的性質(zhì)密切相關(guān)。④綜合評價，分子量小于3kDa的褐藻膠寡糖具有較好的抗氧化活性。與Vc、白藜蘆醇、α-硫辛酸、EDTA等單一抗氧化劑相比，系列褐藻膠寡糖及

8、寡糖單體既可以直接清除導(dǎo)致氧化損傷的活性氧自由基，亦可與Fe2+絡(luò)合，間接發(fā)揮抗氧化作用，具有更為廣泛的適用性。
　　3.利用小鼠急性酒精性肝損傷模型，研究了系列褐藻膠寡糖對酒精性肝損傷的防治作用，結(jié)果表明:褐藻膠寡糖可顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)、血清中TG水平及ALT、AST活性，且其作用效果呈現(xiàn)出寡糖聚合度越低，效果越顯著的趨勢，其中以M-3K和G-3K活性最優(yōu)，且二者活性相當(dāng)，說明褐藻膠寡糖對酒精性肝損傷的保護(hù)作用

9、主要與寡糖分子量相關(guān)。進(jìn)一步對褐藻膠寡糖(M-3K和G-3K)的作用機(jī)制研究表明:褐藻膠寡糖能提高機(jī)體非酶類抗氧化物質(zhì)水平及抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化，抑制肝微粒體酶氧化系統(tǒng)(MEOS)中CYP1A2、CYP2E1、CYP3A蛋白表達(dá)，從而減少乙醇代謝過程中ROS的生成，通過抑制乙醇引起的氧化應(yīng)激，保護(hù)肝組織。褐藻膠寡糖能夠提高肝組織中ADH和ALDH活性，加速乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛的清除，降低其肝毒性。褐藻膠寡糖可抑制細(xì)胞炎癥因子TN

10、F-α、IL-6的分泌，提高抗炎因子adiponectin的水平，從而拮抗炎癥引起的肝細(xì)胞凋亡，實現(xiàn)對肝臟的保護(hù)作用。褐藻膠寡糖能夠激活p-AMPK和PPAR-α并抑制mSREBP-1表達(dá)，通過減少脂肪合成，加速脂肪酸β-氧化，從而抑制肝臟脂肪蓄積，改善肝細(xì)胞脂肪變性。
　　4.建立MPP+誘導(dǎo)損傷SK-N-MC細(xì)胞的帕金森癥模型，并對系列褐藻膠寡糖及其單體進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性篩選。結(jié)果表明在寡糖混合物中，聚合度較小的寡糖活性較好

11、，其中以飽和褐藻膠寡糖M-3K和G-3K活性最好。飽和寡糖單體中以五糖活性最好(M5/G5)，且作用優(yōu)于相應(yīng)的M-3K和G-3K組分。M五糖和G五糖能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，提高細(xì)胞內(nèi)GSH和ATP水平，抑制由MPP+引發(fā)的氧化應(yīng)激，從而對神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。進(jìn)一步對其作用機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明其可通過提高線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性及表達(dá)，上調(diào)D J-1和PINK1的表達(dá)拮抗MPP+引起的線粒體功能障礙，此外，M五糖和G五糖亦可上調(diào)A