L-酪氨酸代謝平臺(tái)構(gòu)建及其在丹參素合成中的應(yīng)用.pdf

1、L-酪氨酸是一種重要的芳香環(huán)平臺(tái)化合物,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥以及化工等領(lǐng)域。由于天然微生物合成積累L-酪氨酸的能力很低,研究從生物質(zhì)碳源如葡萄糖到L-酪氨酸途徑的全局代謝優(yōu)化,構(gòu)建高產(chǎn)L-酪氨酸代謝平臺(tái),并應(yīng)用于衍生物的合成具有重要意義。
　　本文基于模塊化代謝工程的理念,設(shè)計(jì)并合成了BldgBrick模塊組裝系統(tǒng),構(gòu)建了包含L-酪氨酸代謝途徑、糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、TCA循環(huán)以及抗逆性基因等12個(gè)基因在的四個(gè)模塊。通過對(duì)模塊之間適配性的篩

2、選發(fā)現(xiàn),由LacUV5啟動(dòng)子控制aroGfbr-tyrAfbr-aroE組成的模塊1和由trc啟動(dòng)子控制的ppsA-tktA-glk組成的模塊2組合在一起的pYBT5質(zhì)粒適配性最佳。利用λRed同源重組技術(shù),通過連續(xù)基因敲除,構(gòu)建了ptsG、tyrR、pykA、pykF和pheA的5個(gè)不同缺失的BAK底盤菌株。模塊與底盤細(xì)胞的適配性表明,pYBT5與BKT5菌株為最優(yōu)L-酪氨酸工程菌株,發(fā)酵72h,L-酪氨酸產(chǎn)量為702mg/L,產(chǎn)率達(dá)

3、到理論得率19.5％。利用人工設(shè)計(jì)anti-csrAsRNA2沉默E.colicsrA基因,提高L-酪氨酸產(chǎn)量約1.2倍。
　　以L-酪氨酸為平臺(tái)化合物,重新設(shè)計(jì)了由4-羥基苯乙酸間位羥化酶基因(hapBC)和突變的D-乳酸脫氫酶基因(d-ldhY52A)組成的人工丹參素合成模塊,構(gòu)建了丹參素工程菌株BKD5。發(fā)酵72h的丹參素產(chǎn)量達(dá)7.14g/L,產(chǎn)率為0.47mol/mol葡萄糖。
　　本文采用合成生物學(xué),通過代謝途徑模