兩種引起突發(fā)公共衛(wèi)生事件RNA病毒的分子進(jìn)化研究.pdf

1、研究背景：突發(fā)公共衛(wèi)生事件，是指突然發(fā)生，造成或者可能造成社會(huì)公眾健康嚴(yán)重?fù)p害的重大傳染病疫情、群體性不明原因疾病、重大食物和職業(yè)中毒以及其他嚴(yán)重影響公眾健康的事件?，F(xiàn)有傳染病時(shí)有暴發(fā)和流行、已消滅或被控制的傳染病死灰復(fù)燃以及新發(fā)傳染病不斷出現(xiàn)和暴發(fā)流行對(duì)公共衛(wèi)生安全提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renAlsyndrome, HFRS）是由漢坦病毒（Hantavirus,HV）引起的一種

2、自然疫源性疾病，在我國(guó)已有半個(gè)世紀(jì)的流行史，全國(guó)除青海、臺(tái)灣省外均有疫情發(fā)生，嚙齒類動(dòng)物是病毒主要宿主。我國(guó)的HFRS 主要是漢灘病毒（Hantaan virus, HTNV）和漢城病毒（Seoul virus, SEOV）所引起，前者的毒力要大于后者，所導(dǎo)致的臨床癥狀也更為嚴(yán)重。本課題研究對(duì)象之一的寧波市位于我國(guó)的東南沿海，屬于半潮濕氣候環(huán)境，適合漢坦病毒宿主嚙齒類動(dòng)物的繁殖和生長(zhǎng)，HFRS一直以來都是當(dāng)?shù)匾环N主要的自然疫源性疾病，隨

3、著疾病監(jiān)測(cè)體系的完善和公共衛(wèi)生水平的提高，自1997年以后，該市HFRS 疫情呈逐年下降態(tài)勢(shì)。但是近年來，HFRS又有死灰復(fù)燃的趨勢(shì)，并在2009-2010年出現(xiàn)了疫情相對(duì)高發(fā)狀態(tài)，此外，對(duì)寧波地區(qū)漢坦病毒流行株實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和分子進(jìn)化研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。新型甲型H1N1流感作為新發(fā)重大傳染病于2009年3月17日在墨西哥、美國(guó)等國(guó)家首先發(fā)現(xiàn)并迅速傳遍世界，引起全球的普遍關(guān)注。據(jù)世界衛(wèi)生組織2010年8月6日公布的最新疫情通報(bào)，截至2010

4、年8月1日，214個(gè)國(guó)家報(bào)告了實(shí)驗(yàn)室新型甲型H1N1流感確診病例，在全球已造成至少18449人死亡。據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部通報(bào)，截至2010年1月10日，中國(guó)內(nèi)地已有124764例甲型H1N1流感確診病例，其中744例死亡。造成本次流感流行的新型甲型H1N1病毒是以北美豬流感病毒（Swine influenza virus, SIV）為基本骨架，與禽流感、歐亞大陸豬流感病毒等基因重排的結(jié)果，人群沒有或很少對(duì)該型病毒具有免疫能力，且病毒極易在人和人

5、之間傳播。豬流感病毒基因在1930到1990年間只經(jīng)歷了較小的進(jìn)化，但是，從上世紀(jì)90年代末期開始，人、禽和豬三者重排病毒開始在豬中出現(xiàn)，人感染豬流感病毒的病例呈不斷增多的趨勢(shì)，特別是與豬接觸較為密切的養(yǎng)豬工人，但都呈散發(fā)狀態(tài)，與此同時(shí)，豬流感病毒在人與人之間也罕見傳播，因此豬源流感病毒從偶可感染人，到2009年的大規(guī)模暴發(fā)流行，其病毒分子必定經(jīng)歷了基因重排與選擇性進(jìn)化，對(duì)豬源流感病毒從散發(fā)到暴發(fā)流行進(jìn)化過程的分析也具有重要的流行病學(xué)意

6、義。
　　 研究目的：本研究旨在應(yīng)用流行病學(xué)原理，通過現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)、實(shí)驗(yàn)室處理和生物信息學(xué)方法探討兩種引起突發(fā)公共衛(wèi)生事件病毒分子（漢坦病毒和新型甲型H1N1流感病毒）的生物進(jìn)化狀況，揭示寧波市漢坦病毒流行毒株和毒株的分子進(jìn)化狀況；探討可導(dǎo)致人類感染的豬源甲型H1N1流感病毒從散發(fā)到流行的分子進(jìn)化特征，并為公共衛(wèi)生以及衛(wèi)生防疫工作提供一定的理論依據(jù)。
　　 研究方法：首先，本研究通過寧波市疾病預(yù)防與控制中心收集近年HFRS

7、疫情數(shù)據(jù)，探討寧波市HFRS 疫情的發(fā)病特點(diǎn)與規(guī)律，捕獲漢坦病毒宿主嚙齒類動(dòng)物以及收集HFRS患者血清標(biāo)本，應(yīng)用Invitrogen 公司的TRIzol? Reagent 試劑盒和QIAGEN公司的QiAamp VirAlRNA Mini Kit 試劑盒提取RNA分子，并應(yīng)用promega A3500試劑盒和自設(shè)引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增漢坦病毒M 片段基因，通過GenBank 獲得漢坦病毒M 片段參考序列，使用MEGA4 軟件(Mol

8、ecular Evolutionary Genetics AnalysisVERSION 4)，采用neighbor-joining (NJ) 法構(gòu)建進(jìn)化樹(bootstrap=1000replicates)。
　　 其次，本研究通過文獻(xiàn)檢索歷史上報(bào)道過的人感染豬流感病例，并在GenBank上提取相應(yīng)的各片段分子序列以及參考序列，通過分子生物學(xué)軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(phylogenetic analysis)、分子重排分析(bo

9、otscan analysis)和適應(yīng)性進(jìn)化分析(adaptiveevolution analysis)，揭示可導(dǎo)致人類感染的豬源甲型H1N1流感病毒從散發(fā)到流行的分子進(jìn)化特征。
　　 研究結(jié)論：對(duì)于引起公共衛(wèi)生突發(fā)事件的兩種RNA 病毒，寧波市漢坦病毒流行株為SEOV 且M 段基因未發(fā)生變異，可導(dǎo)致人類感染的豬源甲型H1N1流感病毒從散發(fā)到流行的分子進(jìn)化經(jīng)歷了兩個(gè)比較關(guān)鍵的步驟，首先于2005年左右完成了北美古典豬、北美的禽和