冬凌草甲素的聚乙二醇修飾物的合成及其體內外性質的研究.pdf

1、冬凌草甲素(oridonin，ORI)是由唇形科(Labtea)香茶菜屬(Rabdosia)植物冬凌草中提取出的一種貝殼杉烯二萜類有機化合物。有研究表明，冬凌草甲素具有較強的抗腫瘤活性，對多種腫瘤細胞具有抑制增殖和促凋亡作用，其分子中與環(huán)外亞甲基共軛的環(huán)戊酮結構是其抗癌活性中心，對白血病、肝癌、食管癌、結腸癌、肺癌等均有一定的療效。然而冬凌草甲素難溶于水及一般有機溶劑，吸收率低，體內生物半衰期短，這些缺陷都影響了其臨床療效，目前有關制劑

2、的臨床抗癌療效并不理想，因此，需要尋求新的方法以增加冬凌草甲素水溶性、改善其生物利用度，從而提高其抗癌療效。
　　前藥的設計可有效地解決某些藥物的水溶性和穩(wěn)定性問題，增加藥物在血液循環(huán)中存留的時間，改變藥物體內分布特性，從而提高藥物生物利用度，降低藥物毒副作用。近年來，一些大分子前藥引起了研究者極大的關注，它可通過延長藥物在體內的半衰期來提高藥效，避免降解，增加藥物的穩(wěn)定性;還可提高細胞通過內吞作用對藥物的攝取，通過配體使藥物對靶

3、向細胞有效位點特異性識別。
　　在各種高分子材料中，聚乙二醇以良好的水溶性、無毒、良好的生物相容性和無免疫原性等其他高分子無法比擬的優(yōu)點，在前藥的合成與制備中占有非常重要的地位。聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)是一種pH中性、無毒、水溶性較高的親水性聚合物，其重復單元為氧乙烯基，端基為兩個羥基，呈線性或支化鏈狀結構。PEG在修飾小分子藥物時，可以將它的許多優(yōu)良性質隨之賦予所形成的復合物，如提高被修飾藥物的溶

4、解性、延長藥物循環(huán)半衰期和增強療效等，這使得許多療效顯著但由于其疏水性和毒性大等缺陷而限制臨床應用的小分子藥物有了新的發(fā)展前景。
　　本課題以冬凌草甲素為模型藥物分子，以甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)為水溶性骨架，丁二酸為間隔分子，制備得到了4種不同分子量的冬凌草甲素的聚乙二醇修飾物，并考察了合成路線中反應物配比、反應溫度、反應時間、催化劑用量與配比、冰浴時間等對產物產率的影響，從而確定了較適合的反應條件，用于冬凌草甲素的聚

5、乙二醇修飾物的制備。采用紅外光譜(FTIR)及高效凝膠色譜(SEC-HPLC)對四種甲氧基聚乙二醇胺修飾的冬凌草甲素(PEG-SA-ORI)前藥進行了初步結構鑒定，結果證明小分子藥物冬凌草甲素確實連接到了高分子的甲氧基聚乙二醇胺骨架上。
　　運用紫外分光光度法(UV)測定四種不同分子量的PEG-SA-ORI衍生物中的冬凌草甲素含量，通過對比四種衍生物發(fā)現，其中ORI含量的大小主要取決于所用甲氧基聚乙二醇胺的分子量，PEG5kDa-

6、SA-ORI衍生物的ORI含量最高，其冬凌草甲素的偶聯率達到89.4％，而PEG40kDa-SA-ORI衍生物的ORI含量最低，其偶聯率為48.9％。
　　使用直接觀察法研究了四種不同分子量的衍生物在水中的溶解性，結果表明，與水溶性很差的小分子冬凌草甲素相比，所合成的四種聚乙二醇修飾物均使得冬凌草甲素的水溶性有所改善。其中分子量最大的PEG40kDa-SA-ORI衍生物在水中的溶解度為789.4mg·mL-1（相當于冬凌草甲素3.

7、51mg·mL-1，提高了4.7倍），分子量最小的PEG5kDa-SA-ORI衍生物在水中的溶解度達到1250mg·mL-1（相當于冬凌草甲素74.75mg·mL-1，提高了99.2倍），說明聚乙二醇修飾技術具有很好的增溶效果。
　　采用高效液相色譜法(HPLC)研究了四種聚乙二醇化冬凌草甲素原料藥及其在水溶液中的穩(wěn)定性，結果表明四種衍生物在不同條件下的穩(wěn)定性均較好，其中溫度對其穩(wěn)定性影響較大，溫度升高，冬凌草甲素的解離明顯加快，

8、說明高溫環(huán)境不利于衍生物的貯存。此外，原料藥的穩(wěn)定性顯著高于其在水溶液中的穩(wěn)定性，說明以干粉形式儲存比配制成水溶液更有利于提高PEG-SA-ORI衍生物的穩(wěn)定性。
　　PEG-SA-ORI衍生物在pH5.5及pH7.4兩種環(huán)境下的體外釋藥特性研究表明PEG-SA-ORI衍生物在pH5.5及pH7.4條件下均表現出一定的雙相釋藥特性，在實驗初始階段，其冬凌草甲素解離釋放得較快，而后ORI的釋放速率逐漸減小，藥物緩緩解離釋放至介質中。

9、在相同pH條件下不同分子量的PEG-SA-ORI衍生物的釋放研究顯示其中ORI的釋放速度及程度與甲氧基聚乙二醇胺的分子量大小密切相關，分子量較大的PEG-SA-ORI分子中ORI解離的較慢。在不同pH環(huán)境下，PEG-SA-ORI衍生物中的ORI釋放有所不同，PEG-SA-ORI在pH5.5的釋放介質中更易釋放出ORI，說明PEG-ORI-SA具有一定pH敏感性，弱酸性環(huán)境更有利于其釋放出藥物分子發(fā)揮作用。
　　采用MTT法考察了P

10、EG-SA-ORI衍生物及冬凌草甲素溶液在不同濃度和不同時間對人白血病K562細胞的體外抑制活性。實驗結果表明PEG-SA-ORI衍生物對人白血病K562細胞具有生長抑制作用，且這種抑制作用呈現明顯的時間和濃度依賴性。隨著作用時間延長，PEG-SA-ORI衍生物作用效果增強。Hoechst染色法觀察了PEG-SA-ORI衍生物處理后K562細胞的形態(tài)，發(fā)現正常細胞Hoechst染色后染色質分布均勻，細胞核完整，細胞呈均勻淡藍色，而PEG

11、-SA-ORI及ORI溶液處理后的細胞核呈現明亮藍色熒光，表現致密濃染，說明ORI及其PEG衍生物促進了K562細胞的凋亡，PEG-SA-ORI能夠有效地釋放出活性成分冬凌草甲素。
　　本文采用高效液相色譜法(HPLC)分別測定了大鼠尾靜脈注射PEG10K-SA-ORI、PEG20K-SA-ORI和ORI溶液后其血液中冬凌草甲素的經時變化規(guī)律。研究結果表明PEG-SA-ORI衍生物的藥物動力學特征與ORI-Sol差別很大。靜脈注射

12、ORI-Sol后，雖然檢測到初始的冬凌草甲素濃度較高，但很快便被清除，清除率CL為0.505L·h-1·Kg-1，平均滯留時間很短為1.32h，而PEG-SA-ORI衍生物的藥物濃度-時間曲線則更為平緩，并且在24h時血液中的冬凌草甲素仍能維持一定水平，PEG10K-SA-ORI的平均滯留時間達到14.50h，清除率CL為0.232L·h-1·Kg-1，而PEG20K-SA-ORI的平均滯留時間達22.44h，清除率CL為0.230L·

13、h-1·Kg-1。說明聚乙二醇修飾作用可明顯改變小分子藥物的藥物動力學特征，它可通過延長藥物在體內的循環(huán)時間從而提高藥物的治療效果。
　　本課題將聚乙二醇修飾的方法引入冬凌草甲素前藥的合成中，并對其合成條件及構建方法、工藝與理化性質、抗腫瘤活性及動物體內藥物代謝動力學等內容進行了系統研究。這些新型聚乙二醇化的冬凌草甲素的進一步非臨床和臨床評價將很有可能為白血病患者帶來一個有價值的治療選擇。我們的研究成果同時也證明聚乙二醇化技術為小