羧甲基殼聚糖促進(jìn)口服藥物腸道吸收機(jī)制的初步研究.pdf

1、許多具有特異療效的生物大分子藥物采用口服給藥難以通過腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)，極大地限制了其應(yīng)用。殼聚糖(Chitosan，CS)作為口服藥物載體具有打開上皮細(xì)胞緊密連接(TJ)增強(qiáng)藥物細(xì)胞旁路運(yùn)輸?shù)哪芰?，殼聚?羧甲基殼聚糖(CS/CMCS)納米載體能夠更有效地促進(jìn)口服藥物透腸吸收，提高口服生物利用度，但CMCS結(jié)構(gòu)與腸道細(xì)胞作用的分子機(jī)制尚不明確。本文通過制備具有不同取代度的CMCS材料體系，以Caco-2細(xì)胞構(gòu)建腸道吸收模型，研究了C

2、MCS不同分子結(jié)構(gòu)與其作為載體材料促進(jìn)口服藥物透腸吸收之間的關(guān)系。
　　利用殼聚糖(CS)與氯乙酸反應(yīng)技術(shù)，通過控制反應(yīng)時(shí)間，成功合成了三種羧甲基殼聚糖(CMCS)樣品，分別命名為CMCS1、CMCS2和CMCS3。在中性條件下，CMCS2和CMCS3比CMCS1表現(xiàn)出更好的水溶性;三種CMCS樣品紅外光譜圖證實(shí)羧甲基基團(tuán)（-CH2COOH）成功地連接到了CS的分子骨架上，羧基特征峰面積的差異反映出羧基含量的不同;CS原料的分子量

3、為397.SkDa，CMCS1、CMCS2、CMCS3的分子量分別為449.1kDa、540.7kDa和605.1kDa，羧甲基取代度分別為36％、100％、145％，產(chǎn)物的分子量和取代度隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增大。CMCS1和CMCS2的羧甲基取代主要發(fā)生在C6位的-OH上，產(chǎn)物以O(shè)-CMCS為主。CMCS3的羧甲基取代在C6位的-OH達(dá)到飽和后繼續(xù)發(fā)生在C2位的-NH2上，生成產(chǎn)物主要為N，O-CMCS;三種CMCS樣品中由于引入了羧基

4、基團(tuán)（-COO-），其Ca2+螯合能力均顯著高于CS原材料，且隨著羧甲基基團(tuán)取代度的增加，Ca2+螯合能力逐漸增強(qiáng)。
　　通過MTT法評價(jià)了CS原料和三種取代度CMCS樣品的細(xì)胞毒性，72h實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，浸提液濃度在0.0625mg/mL-1mg/mL范圍內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞相對增殖率均超過100％，四種材料對HUVEC、MEF和Caco-2細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。并且，CS、CMCS1、CMCS2和CMC3對HUVEC和ME

5、F的生長都有明顯的促進(jìn)作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，促生長作用隨著材料浸提液濃度的提高而增強(qiáng)。
　　TEER分析結(jié)果表明，0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL濃度的CS和三種CMCS樣品浸提液處理Caco-2細(xì)胞致密單層后，細(xì)胞單層TEER值在1h內(nèi)表現(xiàn)為先迅速下降后逐漸上升。TEER值降低速度隨材料濃度的增加而增大，TEER值最大降幅隨CMCS羧甲基取代度的增大而增大。全部實(shí)驗(yàn)組對Caco-2細(xì)胞致密單層作用過程均

6、表現(xiàn)出可逆性。其中，0.5 mg/ml和1 mg/ml CMCS3具有明顯較強(qiáng)的打開細(xì)胞TJ的能力。
　　緊密連接蛋白Claudin-4免疫熒光研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/ml的CS和CMCS3作用前，細(xì)胞膜上存在大量Claudin-4蛋白，細(xì)胞間的TJ處于完整狀態(tài);作用15min后，熒光信號(hào)明顯減弱，Claudin-4蛋白急劇減少，細(xì)胞間TJ被打開;作用30 min和60 min后，熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，Claudin-4蛋白量持續(xù)增加

7、，細(xì)胞間TJ逐漸恢復(fù)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果與TEER分析結(jié)果一致，均證實(shí)CMCS3能夠有效打開Caco-2細(xì)胞之間的TJ結(jié)構(gòu)，從而增加細(xì)胞旁通路的滲透性。
　　研究發(fā)現(xiàn)，高取代度的CMCS表現(xiàn)出更強(qiáng)的打開細(xì)胞TJ的能力。一方面依賴于其介導(dǎo)的跨膜蛋白Claudin-4在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移和重新分布，另一方面通過其更強(qiáng)的Ca2+螯合能力使鈣粘素因Ca2+流失而失活，破壞細(xì)胞粘附連接(AJ)結(jié)構(gòu)進(jìn)而打開細(xì)胞TJ。該研究結(jié)果為對羧甲基殼聚糖載體材