兩種新型抗菌性哌嗪聚合物的制備及生物學(xué)評價(jià).pdf

1、細(xì)菌在給人類帶來益處的同時(shí)，也時(shí)刻威脅著人類的生活和健康。面對致病菌的威脅，抗生素的使用必不可少。然而，隨著細(xì)菌耐藥性的愈演愈烈以及有效抗生素的日趨減少，開發(fā)不依賴于傳統(tǒng)抗生素結(jié)構(gòu)修飾或改造的新型抗菌材料具有十分重要的意義。針對這個問題，本研究在比較了現(xiàn)有無機(jī)抗菌劑和有機(jī)抗菌劑后，選擇高分子抗菌材料為研究對象，以哌嗪（PA）和乙二胺四乙酸二酐（EDTAD）為原料設(shè)計(jì)并制備了一種具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的新型哌嗪聚合物PE。首先，利用傅立葉變換紅外光

2、譜儀（FTIR）、核磁共振波譜儀（ NMR）、元素分析儀（EA）、差示掃描量熱計(jì)（DSC）、熱重分析（TG）以及光學(xué)顯微鏡等對其基本結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了系統(tǒng)表征；接著，考察了PE對革蘭氏陽性菌-金黃色葡萄球菌（S.aureus）和革蘭氏陰性菌-大腸桿菌（E.coli）及相應(yīng)生物膜形成過程的影響；然后，利用掃描電鏡（SEM）、透射電鏡（TEM）、FTIR、紫外分光光度計(jì)（UV）、酶標(biāo)儀、凝膠電泳等對PE的抗菌作用機(jī)理進(jìn)行了探討；最后，采用SD

3、大鼠乳鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞檢測了PE的細(xì)胞毒性。在對PE的抗菌性能和細(xì)胞毒性進(jìn)行了系統(tǒng)的評價(jià)后，本研究進(jìn)一步將與成骨細(xì)胞功能表達(dá)相關(guān)的生物活性因子MGF-Ct24E引入到PE的分子結(jié)構(gòu)中以期制備出另一種具有更小細(xì)胞毒性的新型抗菌性哌嗪聚合物PEM。對于所獲得的產(chǎn)物，采用FTIR、NMR、EA、氨基酸分析儀（AAA）、DSC及TG等對其基本結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了表征；然后，評價(jià)了PEM的體外抗菌性能和細(xì)胞毒性，并與PE進(jìn)行了系統(tǒng)的比較；最后，將兩種

4、新型哌嗪聚合物PE和PEM與具有良好生物相容性和骨傳導(dǎo)性的多孔羥基磷灰石（HA）陶瓷支架進(jìn)行復(fù)合，并對所得復(fù)合物的抗菌性能和生物相容性進(jìn)行了初步評價(jià)。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下所述：
　?、僖訮A和EDTAD為原料通過一種簡單且綠色的方法制備了一種新型的哌嗪聚合物PE：
　　1）FTIR、13C NMR和EA的分析結(jié)果表明，PE分子中的PA和EDTAD基本以1：1進(jìn)行反應(yīng)，最后形成了兩端為羧基封端的聚合物。
　　2）熱分析

5、結(jié)果顯示PE的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）為50.09℃，熱分解溫度為200℃。
　　3）當(dāng)PE溶液處于較低溫度時(shí)，由于分子內(nèi)和分子間氫鍵的作用，會形成直徑約為5μm的凝膠，而隨著溫度的升高（45℃），該凝膠態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿芤簯B(tài)。
　?、趯⑿滦瓦哙壕酆衔颬E作用于E.coli和S.aureus，以考察其相應(yīng)的抗菌性能，檢測指標(biāo)主要包括：細(xì)菌敏感性、MIC和 MBC值，細(xì)菌生長抑制情況以及與細(xì)菌生物膜形成過程相關(guān)的游離細(xì)菌和粘附細(xì)菌的

6、快速殺滅作用，細(xì)菌生物膜生長抑制情況等。除此之外，還考察了環(huán)境因素對PE抗菌性能的影響。所得結(jié)果如下所示：
　　1）與環(huán)丙沙星對照組相比，PE能夠更好地抑制和殺滅E.coli和S.aureus，且其對E.coli的作用效果更明顯。
　　2）PE對E.coli和S.aureus的MIC值受到環(huán)境 pH值和最初細(xì)菌接種量的影響，具體表現(xiàn)為：隨著環(huán)境pH值的上升，PE對兩種細(xì)菌的MIC值均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢；隨著兩種細(xì)菌初始

7、接種量的增加，PE相應(yīng)的MIC值增大。
　　3）PE能夠顯著的影響細(xì)菌生物膜的形成過程，具體表現(xiàn)為：與環(huán)丙沙星對照組相比，PE能夠濃度依賴性的對游離細(xì)菌和粘附細(xì)菌起到更好的快速殺滅作用，且其對細(xì)菌生物膜生長的抑制作用與環(huán)丙沙星對照組相當(dāng)。
　?、蹖⒁欢舛鹊腜E作用于E.coli和S.aureus一段時(shí)間后，采用SEM和TEM觀察細(xì)菌形態(tài)的變化；采用FTIR和UV檢測細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分的改變；檢測培養(yǎng)液中K+和Mg2+的濃度

8、以及乳酸脫氫酶（LDH）和β-半乳糖苷酶的活性等以考察PE對細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響；檢測菌體內(nèi)DNA的含量和破損情況以了解PE對細(xì)菌遺傳物質(zhì)的影響。結(jié)果如下所示：
　　1）PE會直接作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，破壞其結(jié)構(gòu)，并使得細(xì)菌內(nèi)容物泄漏，DNA丟失。
　　2）PE會直接作用于細(xì)菌的遺傳物質(zhì)DNA，使其發(fā)生斷裂，并最終影響細(xì)菌的分裂增殖。
　　④將PE與SD大鼠乳鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，以檢測其細(xì)胞毒性，具體

9、包括PE對成骨細(xì)胞形態(tài)、鋪展、增殖、周期、分化及礦化的影響，所得結(jié)果如下所示：
　　1）PE作用于成骨細(xì)胞4h后幾乎不會對其鋪展造成影響，而隨著培養(yǎng)時(shí)間延長到24h時(shí)，PE對成骨細(xì)胞鋪展的影響呈現(xiàn)出濃度依賴性，但是均優(yōu)于環(huán)丙沙星對照組。
　　2）PE會濃度依賴性地抑制成骨細(xì)胞的增殖；其主要作用方式包括：一、當(dāng)PE濃度達(dá)到一定值后，會對成骨細(xì)胞的鋪展造成影響，并減少最初粘附的細(xì)胞數(shù)目；二、阻礙成骨細(xì)胞進(jìn)入S期，堆積在G1期，從

10、而出現(xiàn)G2/M期阻滯現(xiàn)象，并最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞的增殖受到抑制。
　　3）PE會濃度依賴性地影響成骨細(xì)胞的成熟、分化和礦化，且其抑制作用小于環(huán)丙沙星對照組。
　?、菰谙到y(tǒng)地評價(jià)了PE的體外抗菌性能和細(xì)胞毒性后，以EDC和NHS為縮合劑，將力生長因子MGF-Ct24E引入到PE的分子結(jié)構(gòu)中從而制備出了另一種新型哌嗪聚合物PEM：
　　1）FTIR、13C NMR、EA和AAA的分析結(jié)果表明，MGF-Ct24E已經(jīng)在PE中成功

11、引入，且其含量約為1.39μmol/g。
　　2）熱分析結(jié)果顯示PEM的Tg為36.56℃，熱分解溫度為315℃。
　?、逌y試了PEM的體外抗菌活性和細(xì)胞毒性，并與PE進(jìn)行了系統(tǒng)的比較，所得結(jié)果如下所示：
　　1）與PE相比，PEM對E.coli和S.aureus的MIC值和MBC值有所增加，但是對應(yīng)濃度的PEM卻表現(xiàn)出了比PE更優(yōu)的抗菌性能。
　　2）SEM和TEM的結(jié)果顯示，PEM與PE具有相似的抗菌機(jī)理，即

12、破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，并使得遺傳物質(zhì)DNA發(fā)生斷裂或呈現(xiàn)濃縮緊張態(tài)。
　　3）細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MGF-Ct24E的引入不僅會降低材料的細(xì)胞毒性，而且會發(fā)揮MGF-Ct24E相關(guān)的生物學(xué)功能。
　　⑦將針狀的HA和球狀的HA按照一定比例進(jìn)行混合后燒結(jié)，獲得具有一定力學(xué)強(qiáng)度的多孔HA陶瓷支架，將PE和PEM分別與該支架進(jìn)行復(fù)合后評價(jià)所得復(fù)合物的抗菌性能和生物相容性，結(jié)果如下所示：
　　1）FTIR和SEM結(jié)果