基于納米材料-酶復(fù)合組裝的藥物代謝和免疫分析研究.pdf

1、酶是一種重要的生物催化劑，調(diào)節(jié)著生物體內(nèi)大多數(shù)生命活動(dòng)和生物系統(tǒng)中的信號(hào)傳遞，而生物體內(nèi)的酶大多不是單獨(dú)存在，它們或是溶解于細(xì)胞質(zhì)中，或是與各種膜結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起，或是位于細(xì)胞內(nèi)其他結(jié)構(gòu)的特定位置上，發(fā)揮其獨(dú)特的生物催化性能。因此，模擬生物體內(nèi)微環(huán)境，研究酶在納米結(jié)構(gòu)材料上的組裝、生物活性、電子轉(zhuǎn)移、能量傳遞、催化和代謝行為，有助于我們探究生命活動(dòng)，揭示與闡述生物分子的相互作用及其代謝反應(yīng)本質(zhì)。針對(duì)這一研究目的，本論文設(shè)計(jì)合成了多種納米結(jié)

2、構(gòu)復(fù)合材料，并在該納米結(jié)構(gòu)上組裝不同類型的模型酶，構(gòu)建具有生物催化功能的納米反應(yīng)器和生物傳感器，研究固定化酶的生物活性、催化協(xié)同效能及其在生物傳感方面的應(yīng)用。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)生命活動(dòng)和生物系統(tǒng)中的信號(hào)傳遞大多是由多種生物分子共同參與完成的。體外模擬生物系統(tǒng)中酶的組裝對(duì)于研究藥物級(jí)聯(lián)代謝過程中酶的協(xié)同作用具有重要的作用。鑒于此，以石墨烯作為固相基質(zhì)，通過共價(jià)方式將細(xì)胞色素P4501A2酶(CYP1A2)和UDP-葡萄糖

3、醛酸轉(zhuǎn)移酶1A10(UGT1A10)分別結(jié)合在兩片石墨烯復(fù)合膜上，利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將這兩片石墨烯復(fù)合膜連接起來構(gòu)建石墨烯納米籠，組裝CYP1A2/UGT1 A10雙酶復(fù)合物，通過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)方式，以華法林作為底物，研究藥物級(jí)聯(lián)代謝過程。研究結(jié)果表明，組裝在石墨烯籠中的酶具有優(yōu)良的電化學(xué)活性，有效保證了底物代謝通道的形成，對(duì)華法林的級(jí)聯(lián)代謝具有較高的催化效率。通過改變連接石墨烯籠上下層的聚乙二醇(PEG)的分子量，可以有效地調(diào)節(jié)納米籠的層間

4、距，從而可以改變酶復(fù)合物的催化活性。另外改變酶在納米籠中的負(fù)載位置，其電化學(xué)性能也隨之改變。因而本課題所構(gòu)建的石墨烯納米籠將為體外模擬生物組織以及研究生物分子的基本活動(dòng)提供平臺(tái)。
　　(2)受天然體內(nèi)多酶復(fù)合物的高催化效率的啟發(fā)，在體外構(gòu)建人工多酶復(fù)合物，模擬天然體內(nèi)的代謝途徑，在酶工程研究中已引起廣泛的興趣。鑒于此，將細(xì)胞色素P450(CYP450)兩種酶組裝于金納米粒子/殼聚糖/石墨烯納米復(fù)合膜(Au/CS/GR)上構(gòu)建CYP

5、450雙酶復(fù)合物，利用電化學(xué)驅(qū)動(dòng)的方式，研究藥物的級(jí)聯(lián)代謝。所制備的Au/CS/GR納米復(fù)合膜同時(shí)兼顧優(yōu)良的導(dǎo)電性、生物兼容性和含有豐富的功能基團(tuán)等特點(diǎn)，是組裝生物分子的理想基質(zhì)。當(dāng)模型雙酶，CYP1A2和CYP3A4酶通過Au/CS/GR上氨基和羥基共價(jià)依次組裝于Au/CS/GR納米復(fù)合膜上時(shí)，因?yàn)镃YP1A2和CYP3A4的電化學(xué)氧化還原峰的重疊，在-0.531和-0.474V(vs.SCE)處出現(xiàn)一對(duì)穩(wěn)定、對(duì)稱的氧化還原峰，證明C

6、YP450雙酶復(fù)合物具有很好的電化學(xué)活性。利用電化學(xué)驅(qū)動(dòng)方式，CYP450雙酶復(fù)合物顯示較強(qiáng)的協(xié)同催化性能，經(jīng)CYP1A2代謝底物氯吡格雷生成的中間產(chǎn)物2-氧代氯吡格雷，經(jīng)CYP3A4代謝可迅速地轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物羧基化氯吡格雷。該級(jí)聯(lián)代謝過程可通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)進(jìn)行驗(yàn)證。另外，所設(shè)計(jì)的CYP450雙酶復(fù)合物還可以用來原位檢測(cè)氯吡格雷含量，測(cè)定靈敏度達(dá)143.4μAmM-1，檢測(cè)下限(LOD)為0.63μM。因此，C

7、YP450雙酶復(fù)合物的成功構(gòu)建為利用電化學(xué)驅(qū)動(dòng)方式研究級(jí)聯(lián)酶催化反應(yīng)提供平臺(tái)，而且在毒性物質(zhì)檢測(cè)的生物傳感器和化學(xué)合成的生物反應(yīng)器的構(gòu)建有著潛在的應(yīng)用。
　　(3)探索和了解限域空腔內(nèi)酶催化反應(yīng)對(duì)理解生命過程信號(hào)傳遞具有重要的推動(dòng)作用。利用靜電吸附法將活性酶固定在TiO2納米管陣列（TNA）內(nèi)壁從而構(gòu)建CYP2C9/Au/TNA納米管陣列酶反應(yīng)器。通過改變陽(yáng)極氧化電位和氧化時(shí)間合成不同大小尺寸的TNA，并在其內(nèi)壁電沉積金納米粒子以

8、改善其導(dǎo)電性，以細(xì)胞色素P4502C9酶(CYP2C9)作為模型酶固定在TNA管腔中。通過改變納米管內(nèi)徑和管長(zhǎng)可以有效地調(diào)節(jié)CYP2C9的酶活性和對(duì)底物甲苯磺丁脲的代謝產(chǎn)率。當(dāng)TNA管內(nèi)徑和管長(zhǎng)分別約64nm和1.08μm時(shí)，酶催化速率常數(shù)kcat和表觀米氏常數(shù)Kmapp分別為9.89s-1和4.8μM。甲苯磺丁脲的最高代謝產(chǎn)率達(dá)到14.6％。另外，本課題所設(shè)計(jì)的TiO2納米管陣列也可以用于原位監(jiān)測(cè)甲苯磺丁脲含量，檢測(cè)靈敏度達(dá)28.8μ

9、A mM-1，檢測(cè)下限(LOD)為0.52μM。因而，該納米管陣列酶反應(yīng)器作為一個(gè)優(yōu)良“容器”，可以用于研究酶生物催化和藥物代謝，同時(shí)也可以潛在地應(yīng)用于生物傳感器的設(shè)計(jì)和用于化學(xué)合成的生物反應(yīng)器的構(gòu)建。
　　(4)受生物體內(nèi)酶催化機(jī)制的啟發(fā)，首先合成了光敏劑2，9，16，23-四氨基鈷酞菁（CoTAPc）和還原態(tài)氧化石墨烯(RGO)納米復(fù)合物(CoTAPc/RGO)。經(jīng)可見光照射，該復(fù)合物中CoTAPc激發(fā)態(tài)的電子可以經(jīng)由RGO快

10、速傳遞至細(xì)胞色素P450酶的血紅素中心，觸發(fā)細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的催化循環(huán)反應(yīng)過程進(jìn)行。為了解體內(nèi)酶催化反應(yīng)的基本功能，我們通過將C YP3A4/CoTAPc/RGO復(fù)合物靜電吸附在有序二氧化硅泡沫(MOSF)孔內(nèi)，成功構(gòu)建一類新型的基于納米孔的酶催化反應(yīng)器。為驗(yàn)證光驅(qū)動(dòng)代謝過程，選擇7-乙氧基4-三氟甲基香豆素(7-EFC)作為代謝底物，熒光光譜和質(zhì)譜法監(jiān)測(cè)代謝產(chǎn)物。研究結(jié)果表明，分散在磷酸緩沖溶液(PBS，0.1M，pH7.4)中的

11、CYP3A4/CoTAPc/RGO/MOSF對(duì)底物7-EFC有優(yōu)良酶催化活性，親和作用以及較高的代謝效率。當(dāng)MOSF的孔徑約為80nm時(shí)，催化速率常數(shù)kcat為2.73 s-1，表觀米氏常數(shù)Kmapp為27.68μM。7-EFC的代謝產(chǎn)率達(dá)到56％。另外，CYP3 A4/CoTAPc/RGO/MO SF具有較好的穩(wěn)定性，可重復(fù)使用，經(jīng)過十次循環(huán)使用，酶仍能保持85％的活性。因此，該基于納米孔的酶反應(yīng)器為體外研究酶生物催化和藥物代謝研究可

12、提供一個(gè)理想的平臺(tái)，在以光催化進(jìn)行生化合成以及毒物的生物傳感檢測(cè)方面具有潛在的應(yīng)用。
　　(5)建立一種流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光(FI-CL)夾心免疫法用于快速檢測(cè)環(huán)境水樣中微囊藻毒素-LR(MC-LR)。首先，通過磁珠(MB)表面的羧基和聚乙烯亞胺(PEI)上的伯氨基之間形成酰胺鍵，將PEI修飾在磁珠表面形成MB/PEI，接著以戊二醛為交聯(lián)劑將MC-LR抗體(Ab1)共價(jià)固定在PEI/MB形成MB/PEI/Ab1用于捕獲水樣中MC-L

13、R。將辣根過氧化物酶(HRP)和MC-LR抗體(Ab2)共同組裝在二氧化硅納米粒子表面形成信號(hào)探針(Ab2/Si)，通過夾心免疫法連接到磁珠表面形成MB/PEI/Ab1-MC-LR-Ab2/Si。通過流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)發(fā)光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)MC-LR的測(cè)定。結(jié)果表明，與不修飾PEI相比，以MB/PEI作為載體捕獲MC-LR抗體，CL信號(hào)增加9倍。與HRP/Ab2相比，以Si/Ab2作為信號(hào)探針，CL信號(hào)進(jìn)一步增加13倍。在最佳條件下，方