牛乳及飼料中三聚氰胺的檢測方法研究.pdf

1、志賀氏菌屬（Shigella）被劃分到腸桿菌科中，沒有鞭毛和莢膜，革蘭氏染色為陰性桿狀細菌。志賀氏菌具有很高的傳染性，兒童和老人極易可能接觸到被感染的食品和水而導(dǎo)致痢疾志賀氏菌的侵襲和感染。目前的中國境內(nèi)志賀氏菌已作為首要病原菌引發(fā)感染性腸道不適。因此開發(fā)出志賀氏菌高效、靈敏，方便快捷的新型檢測法極為重要。
　　日本榮研化學(xué)株式會Notomi等人在2000年發(fā)明出可以不依賴體內(nèi)環(huán)境的擴增核酸片段前沿技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Lo

2、op-mediated Isothermal Amplification，簡稱LAMP）。本研究采用的實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Real-Time FluorescenceLoop Mediated Isothermal Amplification，簡稱為RTF-LAMP)是對環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的改良;其是在LAMP體系中加入了熒光染料SYBR GreenⅠ，SYBR GreenⅠ可以結(jié)合到雙鏈DNA核酸上，結(jié)合后會發(fā)出比原來增強數(shù)千

3、倍的熒光信號，將此LAMP反應(yīng)體系放入實時熒光檢測儀器進行反應(yīng)，通過實時檢測儀的相應(yīng)軟件可觀察反應(yīng)進程。該方法可隨時終止試驗，控制反應(yīng)進程。
　　本研究最終選取志賀氏菌的ipaH基因為目的基因，利用在線引物設(shè)計軟件PrimerV4設(shè)計并選擇與志賀氏菌的ipaH基因相匹配的特異性引物。通過對反應(yīng)體系中引物的添加量及內(nèi)外引物的比例、Mg2+的添加量、dNTPs的濃度、反應(yīng)溫度、BstDNA聚合酶和熒光染料SYBR GreenⅠ的稀釋倍

4、數(shù)等反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立反應(yīng)體系如下:
　　F3與B3各0.2μmol/L，BIP與FIP各1.2μmol/L，dNTPs終濃度5mmol/L，MgCl2終濃度1.5mmol/L。ThermoPol buffer體系中包含20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl,10mmol/L(NH4)2SO4,2 mmol/L MgCl2,0.1％ TritonⅩ-100，終濃度為2.5μl，Bst DNA

5、 polymerase(8U)終濃度1.0μl,提取的志賀氏菌DNA模板加入2.0μl，10000×SYBR GreenⅠ熒光染料最終稀釋500倍，添加量為0.5μl，滅菌ddH2O將體系最終定量到25.0μl。
　　本研究以3株志賀氏菌和19株其他致病菌作為供試菌株，通過對引物特異性進行驗證，結(jié)果表明只有3株志賀氏菌菌株的檢測結(jié)果為陽性，其他18株食源性致病菌菌株檢測結(jié)果均為陰性，說明本方法檢測志賀氏菌有較高的特異性，可用于該菌

6、的檢測。
　　檢測純菌的靈敏度是4.9CFU/mL，是普通LAMP檢測方法的10倍;人工污染牛奶的檢出限為7.5 CFU/mL;通過限制性內(nèi)切酶PshAⅠ酶切RealAmp擴增產(chǎn)物，測得酶切片段長度與理論值相符，驗證了該反應(yīng)的正確性。
　　通過這個研究所建立的實時熒光環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測志賀氏菌的方法能夠隨時監(jiān)測并直接可以得出檢測結(jié)果，操作簡單，耗時短，特異性強、靈敏度高，實現(xiàn)了志賀氏菌的快速檢測需要，非常有利于基層檢驗檢