組氨酸標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)的合成及其應(yīng)用研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的分離純化是發(fā)展蛋白組學(xué)和進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究與應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。固定化金屬螯合親和層析（IMAC）利用配體和組氨酸標(biāo)簽蛋白的特異親和性，是一種靈敏有效的蛋白分離純化技術(shù)。離子液體作為一種綠色溶劑，由于陽(yáng)離子與陰離子都具有可設(shè)計(jì)性以及對(duì)生物活性分子的化學(xué)穩(wěn)定性，被應(yīng)用在蛋白質(zhì)分子的保存以及分離純化等方面，而近期對(duì)離子液體功能化的研究更是為在離子液體綠色溶劑中發(fā)揮官能團(tuán)的特殊功能提供了思路。本課題將IMAC技術(shù)和功能化離子液體結(jié)合

2、起來(lái)，即合成一種金屬離子配合作用較強(qiáng)的氮雜大環(huán)(TACN)，并將這種對(duì)組氨酸殘基有特異親和性的配體鏈接到一種疏水性離子液體上，形成一種親和性離子液體-離子液體支載TACN的金屬螯合物，來(lái)和蛋白水溶液液液萃取來(lái)一步分離純化組氨酸標(biāo)簽蛋白，并對(duì)這種親和性離子液體的重復(fù)利用能力以及回收再生方法進(jìn)行探究。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)以氯丁腈為原料，同氯化氫反應(yīng)后經(jīng)關(guān)環(huán)得到雙環(huán)瞇唑，再與過(guò)量的1，6-二溴己烷反應(yīng)合成烷基雙環(huán)咪唑陽(yáng)離子的離

3、子液體;以乙二醇、二乙酰胺為原料磺?；蠼?jīng)關(guān)環(huán)、甲基化以及脫除對(duì)甲苯磺酰基等步驟來(lái)合成功能性配體氮雜大環(huán)TACN;將TACN連接到烷基雙環(huán)咪唑陽(yáng)離子上，進(jìn)行陰離子交換使其具有疏水性能，和金屬離子螯合后就形成親和性離子液體AIL。以甲基咪唑和氯丁烷為原料親和加成，疏水性陰離子交換合成萃取溶劑離子液體(IL):[Bdmim][NTf2]。NMR、MS、HRMS對(duì)重要產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和純度鑒定。
　　(2)以組氨酸標(biāo)簽綠色熒光蛋白(His-

4、tagged EGFP)為對(duì)象來(lái)探究IL，AIL/IL，M2+-AIL/IL(M=Cu、Ni、Zn)三種體系對(duì)His-tagged EGFP的親和性能，并通過(guò)熒光強(qiáng)度分析不同體系對(duì)蛋白活性的影響。結(jié)果表明只有完整的M2+-AIL/IL對(duì)目標(biāo)蛋白具有親和能力，而且螯合三種金屬離子的體系所親和的EGFP都不同程度地保持了熒光特性。
　　(3)研究了不同離子強(qiáng)度下M2+-AIL/IL(M=Cu、Ni、Zn)對(duì)His-taggedEGFP

5、親和性能的影響。結(jié)果表明:Zn2+-AIL/IL和Ni2+-AIL/IL隨著離子強(qiáng)度的增大對(duì)目標(biāo)蛋白的親和能力也提高，而Cu2+-AIL/IL呈現(xiàn)先降低后增長(zhǎng)的趨勢(shì)。說(shuō)明離子強(qiáng)度可以改變蛋白質(zhì)分子表面的疏水基團(tuán)的數(shù)量以及和親和介質(zhì)之間的靜電強(qiáng)度等因素來(lái)影響M2+-AIL/IL對(duì)組氨酸標(biāo)簽蛋白的親和能力。同時(shí)還以定量的His-tagged EGFP為對(duì)象，選取梯度含量的M2+-AIL/IL進(jìn)行親和試驗(yàn)，通過(guò)親和目標(biāo)蛋白的量來(lái)判斷出對(duì)于定量

6、目標(biāo)蛋白最適宜的M2+-AIL/IL的用量，以便節(jié)約成本和發(fā)揮親和介質(zhì)的最大功效。
　　(4)選定最適宜的離子強(qiáng)度和M2+-AIL/IL的含量，將M2+-AIL/IL應(yīng)用于從大腸桿菌細(xì)胞裂解物中一步純化目標(biāo)蛋白His-tagged EGFP。結(jié)果表明:Cu2+-AIL/IL對(duì)His-tagged EGFP的親和能力最強(qiáng)，但純化后的純度較低;Ni2+-AIL/IL的親和能力最弱;純化效果最佳的體系為Zn2+-AIL/IL，純化效率約

7、為50％，目標(biāo)蛋白純度約為90％，并對(duì)該體系純化過(guò)程中各組分進(jìn)行紫外光譜分析。還將Zn2+-AIL/IL應(yīng)用到了從大腸桿菌表達(dá)的粗蛋白中提純組氨酸標(biāo)簽的青霉素結(jié)合蛋白，獲得了純度高達(dá)約95％的目標(biāo)蛋白。
　　(5)離子液體的的重復(fù)利用能力以及可回收再生的特性是其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)M2+-AIL/IL連續(xù)親和His-tagged EGFP的過(guò)程中親和性能的變化來(lái)探究M2+-AIL/IL的重復(fù)利用能力，通過(guò)EDTA反復(fù)解吸螯合在配體上的