慢性腎衰脂肪組織炎癥以及脂滴包被蛋白的表達(dá).pdf

1、背景：在過去的數(shù)十年里,我們已經(jīng)取得了關(guān)于白色脂肪組織在新陳代謝和內(nèi)分泌功能的許多知識。占成人體重20-30％的白色脂肪組織是機(jī)體重要的能量儲存場所,對維持高等動物體內(nèi)能量平衡起了非常重要的作用。脂肪酸(FA)以甘油三脂(TAG)的形式存儲于脂肪細(xì)胞內(nèi)。長期饑餓可增強(qiáng)脂肪細(xì)胞內(nèi)TAG分解為FA和甘油,為機(jī)體提供FA作為能量源泉,這個(gè)過程稱為脂解。肥胖、惡病質(zhì)、代謝綜合癥和脂肪營養(yǎng)不良等疾病均能刺激脂肪組織分解增強(qiáng),FA釋放增多。高FFA

2、血癥導(dǎo)致FA異位沉積于非脂肪組織尤其是肝臟和骨骼肌內(nèi),與胰島素抵抗和2型糖尿病的進(jìn)展密切相關(guān),是動脈粥樣硬化和心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。
　　 慢性腎衰(CRF)是一種慢性炎癥消耗性疾病,存在脂肪量減少,脂質(zhì)存儲和動員異?，F(xiàn)象。大量實(shí)驗(yàn)證明體內(nèi)脂質(zhì)分解增強(qiáng)是癌癥病人脂肪量減少的主要原因。在我們前面的研究結(jié)果中,發(fā)現(xiàn)CRF大鼠內(nèi)臟和皮下脂肪組織確實(shí)存在脂質(zhì)分解增強(qiáng)現(xiàn)象,CRF大鼠血清甘油濃度、內(nèi)臟和皮下原代脂肪細(xì)胞及脂肪塊培養(yǎng)所測

3、甘油含量均增加。激素動員情況下,皮下和內(nèi)脂的脂解率顯著增高,慢性腎衰組對激素動員的反應(yīng)比假手術(shù)組更高。CRF組織脂質(zhì)分解增強(qiáng)可能與其胰島素抵抗和動脈粥樣硬化發(fā)生率增高密切相關(guān),但CRF中脂解增強(qiáng)的具體機(jī)制目前仍不清楚。我們前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CRF組內(nèi)臟脂肪脂質(zhì)分解酶hormone-sensitive lipase(HSL)和adipocyte triglyceride lipase(ATGL)的酶活性增加,皮下脂肪脂質(zhì)分解酶HSL和A

4、TGL不僅酶活性增加,表達(dá)也增多可以部分解釋CRF脂解增強(qiáng)的發(fā)生機(jī)制。ATGL和HSL是脂質(zhì)分解的關(guān)鍵酶,共占據(jù)了大鼠白色脂肪組織脂質(zhì)分解酶的95％以上。ATGL的主要作用是將TAG分解為甘油二酯(DG)和FA,HSL將DG分解為甘油一酯和FA,HSL多個(gè)磷酸化位點(diǎn)活化后可增強(qiáng)脂解活性。
　　 脂肪組織不僅是能量儲存場所,同時(shí)也是一個(gè)活躍的內(nèi)分泌器官。近年來的研究發(fā)現(xiàn),不僅脂肪組織增多可引起胰島素抵抗,脂肪組織減少也可參與胰島素

5、抵抗的發(fā)生。在肥胖患者,脂肪組織局部炎癥增強(qiáng)被認(rèn)為是肥胖患者發(fā)生胰島素抵抗的核心環(huán)節(jié)。單核巨噬細(xì)胞浸潤增加,使leukin-6(IL-6),腫瘤壞死因子-α(TNF-α),單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)和其他炎癥因子產(chǎn)生增多。由脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6能刺激脂解。脂肪組織促炎癥因子IL-6和TNF-α分泌增多被證明是癌癥惡病質(zhì)脂解增強(qiáng)的重要因素。TNF-α與膜受體TNFR1結(jié)合,激活下游MAPK激酶ERK1/2和JN

6、K,TNF-α通過降低perilipinA蛋白表達(dá)水平并增強(qiáng)perilipinA蛋白的磷酸化使脂解增強(qiáng)。IL-6是有多種功能的細(xì)胞因子,脂肪組織是IL-6分泌的主要部位。最近的研究指出血清IL-6濃度與脂肪細(xì)胞脂解是密切相關(guān)的。比如,2型糖尿病患者血清IL-6和FFA水平都是顯著增加,提示IL-6可能是脂解的一個(gè)重要誘導(dǎo)因子。此外,將人乳腺脂肪細(xì)胞和3T3-L1脂肪細(xì)胞與IL-6共同孵育24h后,脂解率顯著增強(qiáng)。總之,這些實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了高

7、劑量IL-6在體內(nèi)和體外均能刺激脂解并氧化脂肪。并且研究發(fā)現(xiàn)IL-6是通過激活ERK通路,降低perilipinA蛋白的表達(dá)直接刺激豬脂肪細(xì)胞脂解。有研究證明,在人脂肪細(xì)胞中,Nuclear factor-κB(NF-κB)的激活對TNFα誘導(dǎo)脂解也同樣非常重要,TNFα與NF-κB結(jié)合后,perilipinA蛋白的水平降低。NF-κB是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,在各種生理和病理過程中都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,且NF-κB也成為治療炎癥相關(guān)

8、性疾病的新的靶點(diǎn)。幾乎所有NF-κB通路的誘導(dǎo)均需要IκB-kinase(IKK)的激活。IKKs由IKKα、β、γ三個(gè)亞基組成的復(fù)合物,其中起主要作用的是α和β亞基。在以前的研究中我們發(fā)現(xiàn)慢性腎衰脂肪組織中ERK1/2和JNK通路均活化增強(qiáng),在本研究中我們探討IKK信號通路在慢性腎衰脂肪組織中是否也活化增強(qiáng)。
　　 脂肪主要以甘油三脂的形式存儲于脂肪細(xì)胞的脂滴內(nèi),脂肪細(xì)胞95％的內(nèi)容物均是以TG作為核中心而形成的脂滴。近幾年的

9、研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在脂滴表面包被著一些特異性的蛋白,這些蛋白稱為PAT蛋白家族,是脂滴降解過程的中心環(huán)節(jié)。PAT蛋白家族主要包括perilipinA、ADRP(adipose differentiation-related protein)和TIP47(Tail-Interacting Protein of47 kDa)。其中perilipinA蛋白是脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴相關(guān)蛋白中表達(dá)最豐富的蛋白,同時(shí)也是脂肪細(xì)胞中的主要PKA位點(diǎn)。perilip

10、inA被認(rèn)為是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下脂解的主要因子。無論是脂肪細(xì)胞培養(yǎng)還是perilipinA-/-模型,大量研究表明perilipinA在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂解中起了雙重作用。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,perilipinA包被在脂滴表面阻止胞漿內(nèi)脂酶進(jìn)入脂滴內(nèi),從而行使“門戶”的功能減少甘油三脂分解,使甘油三脂處于極低基礎(chǔ)分解狀態(tài)下。Perilipin基因敲除小鼠體型較瘦,基礎(chǔ)脂解率明顯增強(qiáng),這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果更確定了perilipin可抑制脂肪組織基礎(chǔ)脂解

11、率的重要功能。在兒茶酚胺類等物質(zhì)的刺激下,蛋白激酶A(PKA)和ERK1/2磷酸化perilipinA位點(diǎn),磷酸化的perilipinA可促進(jìn)脂酶聚集于脂滴內(nèi),促進(jìn)脂解活動。ADRP是PAT蛋白家族中另一個(gè)主要成員,其N端與perilipin有高度同源性,其表達(dá)量與細(xì)胞內(nèi)脂肪量密切相關(guān)。大量研究顯示ADRP表達(dá)上調(diào)可增加脂滴內(nèi)甘油三酯含量。與perilipinA功能相同,ADRP至少部分是通過降低甘油三脂分解率對胞內(nèi)TAG和脂滴產(chǎn)生影響

12、。TIP47與ADRP在氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)上有高度同源性,可能在脂滴代謝的某些方面有同樣的功能。有實(shí)驗(yàn)證明ADRP-/-小鼠顯著降低了肝臟細(xì)胞內(nèi)脂滴和內(nèi)脂含量。ADRP和TIP47蛋白表達(dá)降低可增加FFA釋放,促進(jìn)對腎小管上皮細(xì)胞的毒性作用,但其分子機(jī)制仍不完全清楚。TIP47和ADRP基因敲除小鼠證明其脂肪組織脂解率較正常小鼠弱。因此可得出ADRP和TIP47脂滴表面蛋白表達(dá)下調(diào)同樣可刺激脂肪細(xì)胞脂解增強(qiáng)。
　　 雖然我們已

13、證實(shí)慢性腎衰大鼠脂肪組織脂質(zhì)分解增強(qiáng),但其潛在的機(jī)制目前仍不完全清楚,也無相關(guān)報(bào)道。因此,我們以5/6腎切除大鼠作為慢性。腎衰模型,觀察是否存在脂肪組織炎癥增強(qiáng)及脂滴相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,并探討調(diào)節(jié)脂肪組織脂解IKKs信號通路活性。目的在于探討慢性腎衰脂肪脂質(zhì)分解增強(qiáng)的其他可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.二步法5/6腎切除建立慢性腎衰模型
　　 1.1腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉,俯臥位固

14、定于鼠臺上。
　　 1.2 酒精消毒,于大鼠左腹部中1/3脊柱旁開2～3cm處行縱行切口,切口長度約為2～3cm。
　　 1.3 依次切開皮膚和皮下組織,并剪開肌肉暴露腎臟,剝離腎包膜,用無損傷血管鉗夾住腎蒂,切除腎臟的上下極約占左腎的2/3,明膠海綿壓緊上、下極創(chuàng)面止血,放松血管夾,觀察創(chuàng)面不再滲血后還納腎臟回腹腔,逐層縫合肌層及皮膚,酒精消毒手術(shù)切口?？p合前,腹腔內(nèi)滴注青霉素注射液,預(yù)防感染。假手術(shù)組只作腎包膜剝離術(shù)

15、。
　　 1.4 一周后,在脊柱右側(cè)中1/3旁開2～3cm處行縱行切口(切口略高于左側(cè)),分離肌層,游離腎臟,無損傷血管夾夾住腎蒂,4號絲線結(jié)扎腎蒂,切除右側(cè)腎臟,觀察有無出血,縫合肌層和皮膚,酒精消毒手術(shù)切口。假手術(shù)組只作腎包膜剝離術(shù)。
　　 1.5 在整個(gè)手術(shù)完成后的第四、九、十六周大鼠眼眶后靜脈采血測定血清肌酐,血尿素氮。
　　 2.標(biāo)本的收集和處理將大鼠充分麻醉后固定于鼠板上,腹主動脈取血,4℃生理鹽水灌

16、注后取附睪處和腹膜后脂肪作為內(nèi)臟脂肪的代表,從腹股溝切開取該處脂肪為皮下脂肪。EDTA-K2抗凝管收集血標(biāo)本,30min內(nèi)離心15分鐘(4℃3000rpm),留取血清,分裝后-70℃凍存。取附睪和腹股溝處脂肪組織,脂肪的厚度不超過3mm,大小根據(jù)實(shí)際檢材大小決定,通常為1cm2左右,置于10％中性甲醛固定液中固定。余下的脂肪組織保存于錫紙內(nèi),并-70℃凍存。
　　 3.留取血清用全自動生化分析儀檢測血肌酐(SCr)、血尿素(BU

17、N)濃度。
　　 4.血清IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1應(yīng)用商品化ELISA試劑盒檢測。
　　 5.脂肪總RNA的提取用Trizol提取法,逆轉(zhuǎn)錄PCR后用半定量和定量兩種方法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、MAC-1、MIP-1α、ED-1、PU.1因子mRNA表達(dá)。
　　 6.脂肪組織HE染色法觀察脂肪組織有核細(xì)胞數(shù)量,免疫組化法標(biāo)記脂肪組織巨噬細(xì)胞特異性抗體ED-1陽性細(xì)胞以

18、及MAC-1陽性細(xì)胞。
　　 7.脂肪組織IKK通路(p-IKKα/β、IKKα、IKKβ)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(HNE)以及脂滴包被蛋白(perilipinA、ADRP、TIP47)用Western blotting方法來檢測兩組之間的不同表達(dá)。
　　 8.脂肪組織過氧化氫用商品化試劑盒檢測,結(jié)果用蛋白濃度來糾正。
　　 9.統(tǒng)計(jì)方法
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有統(tǒng)計(jì)

19、分析由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0完成。兩個(gè)樣本均數(shù)的比較采用Independent-SamplesT Test,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1. 腎衰大鼠模型的確立在二步法5/6腎切除手術(shù)建立大鼠腎衰模型后的第四、九、十六周采集大鼠血液測定大鼠肌酐,尿素氮水平,發(fā)現(xiàn)在第四周腎衰組的大鼠肌酐水平既有顯著增高(P<0.05)。第九周、第十六周CRF組血甘油三酯水平(P<0.05),BUN也顯著增加(P

20、<0.05)。在十六周時(shí)CRF組的體重比假手術(shù)組減輕(P<0.05)。
　　 2. 5/6腎切除大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1表達(dá)上調(diào)。
　　 3. 5/6腎切大鼠脂肪組織炎癥反應(yīng)增強(qiáng)脂肪組織炎癥細(xì)胞浸潤:我們將sham組和CRF組大鼠內(nèi)臟和皮下脂肪組織固定行HE染色,結(jié)果顯示CRF組單核細(xì)胞浸潤內(nèi)臟和皮下脂肪組織較sham組明顯,有核細(xì)胞數(shù)明顯增多。
　　 脂肪組織TNF-α、IL

21、-1β、IL-6的mRNA表達(dá):TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)定量分析得出,CRF組與sham組相比其mRNA表達(dá)水平提高。
　　 脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤:脂肪組織免疫組化染色顯示CRY組大鼠內(nèi)臟和皮下脂肪組織ED-1、MAC-1陽性細(xì)胞數(shù)均較sham組的增多。
　　 脂肪組織巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白MCP-1、PU.1、MIP-1α、MAC-1、ED-1mRNA的表達(dá):定量PCR結(jié)果顯示CRF組內(nèi)臟和皮下脂肪較s

22、ham組相比,MCP-1、PU-1、MIP-1α、MAC-1、ED-1mRNA的表達(dá)上調(diào)。
　　 4. 脂肪組織IKKα/β的表達(dá)及其活性變化CRF組內(nèi)臟和皮下脂肪組織IKKβ總蛋白表達(dá)較sham組增強(qiáng),p-IKKα/β較sham組相比顯著活化,IKKα總蛋白表達(dá)兩組間無明顯差異。
　　 5. 腎衰大鼠脂肪組織氧化應(yīng)激水平脂肪組織H2O2的含量:CRF組內(nèi)臟和皮下脂肪組織H2O2的釋放量較sham組相比增多。
　　

23、 脂肪組織HNE蛋白的表達(dá):作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一的HNE蛋白,與sham組相比,CRF組內(nèi)臟和皮下脂肪HNE蛋白濃度表達(dá)增強(qiáng)。
　　 6.腎衰大鼠脂肪組織脂滴相關(guān)蛋白的表達(dá)CRF組內(nèi)臟和皮下脂肪組織脂滴包被蛋白PerilipinA、ADRP、TIP47與sham組相比表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1. 慢性腎衰脂肪組織炎癥因子、巨噬細(xì)胞浸潤增加,氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)；
　　 2. 與炎癥相關(guān)的激酶IKK