應(yīng)用紅色熒光蛋白標(biāo)記研究酸脅迫下苜蓿—根瘤菌共生過(guò)程.pdf

1、根瘤菌-豆科植物高效共生固氮體系是自然界中固氮效率最高的體系之一，固定的氮素占全球固氮總量的主要部分，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中也具有重要作用。紫花苜蓿和根瘤菌對(duì)酸性環(huán)境均很敏感，南方大面積的酸性土壤嚴(yán)重阻礙了苜蓿的“北草南引”及其產(chǎn)業(yè)化。所以研究根瘤菌在酸性土壤中與苜蓿植株的識(shí)別、定殖和遷移過(guò)程，找到在酸性土壤中的高效共生固氮體系具有一定意義。已有研究多通過(guò)篩選耐酸苜蓿根瘤菌來(lái)研究其對(duì)根瘤菌-紫花苜蓿共生體系的固

2、氮能力的影響。本研究通過(guò)紅色熒光蛋白(Redfluorescence protein，RFP)標(biāo)記耐酸苜蓿根瘤菌，選取耐酸能力不同的根瘤菌菌株進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力、根瘤菌的群體感應(yīng)變化的研究以及pH對(duì)根瘤菌在苜蓿體內(nèi)定殖和運(yùn)移情況的影響，為耐酸苜蓿根瘤菌與苜蓿植物在酸脅迫下的共生固氮研究提供研究手段。實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果如下:
　　1、用電轉(zhuǎn)化法，成功將rfp基因?qū)隨.meliloti91512、91532中，獲得了rfp標(biāo)記菌株E915

3、12和E91532，標(biāo)記菌株在純培養(yǎng)條件下和共生條件下均能穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白。接種E91512、E91532和接種出發(fā)菌株的苜蓿植株結(jié)瘤動(dòng)力學(xué)曲線沒(méi)有顯著差異，對(duì)苜蓿植株的正常生長(zhǎng)和與苜蓿植株共生固氮沒(méi)有影響。接種根瘤菌處理和不接種對(duì)照相比明顯促進(jìn)了苜蓿植株的生長(zhǎng)，其中E91532對(duì)苜蓿植株的生長(zhǎng)的促進(jìn)作用優(yōu)于E91512。
　　2、用試管水培研究酸性脅迫對(duì)標(biāo)記菌株E91512和E91532對(duì)紫花苜蓿侵染、定殖和遷移的影響，結(jié)果

4、表明，pH5.2的水培液處理較pH5.8和pH7.0處理明顯降低了標(biāo)記菌株從根系向上部的遷移速率，在pH7.0和pH5.8的水培液中，標(biāo)記菌株E91532均能夠在10～15天開(kāi)始從根系向上部莖葉遷移，而pH5.2水培液中標(biāo)記菌株E91532從根系向上部莖葉遷移的時(shí)間推遲至15～20天。E91512和E91532兩菌株在pH5.8的水培液中從苜蓿根系向上部遷移動(dòng)態(tài)過(guò)程不完全一致，pH對(duì)E91512的影響大于E91532，pH5.8時(shí)對(duì)標(biāo)記

5、菌株E91532從苜蓿根系向上部的遷移與pH7.0沒(méi)有顯著差異，但E91512在pH5.8處理從根系向上遷移速率較pH7.0明顯降低。
　　3、在三種pH下，標(biāo)記菌株E91512和E91532均能在苜蓿植株根系、莖部和葉片定殖，定殖密度從多到少依次為根系、莖部和葉片。pH5.2處理的苜蓿植株根系、莖部的根瘤菌群體密度顯著低于pH5.8和pH7.0處理，pH5.2時(shí)可顯著降低根瘤菌在苜蓿植株體內(nèi)的群體密度和遷移速率，酸性脅迫下不僅影

6、響根瘤菌的存活，同時(shí)降低了根瘤菌在植物體內(nèi)的定殖密度和遷移速率。
　　4、用紅色熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)，研究不同耐酸能力菌株在不同酸度土壤和不同接種量下的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力。占瘤率反映菌株的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力，結(jié)果顯示:菌株的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力與菌株自身的遺傳特性和耐酸能力相關(guān)，在黃壤、砂壤和紫色土中，接種E91532+91512體積比1∶1處理中S.meliloti91512的占瘤率分別為12.22％、28.69％和11.80％，遠(yuǎn)低于接種E91532

7、+MA2體積比1∶1處理中S.meliloti MA2的占瘤率分別為68.89％、50.14％和44.44％，在三種土壤中，根瘤菌MA2的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力均高于根瘤菌91512;在酸性黃壤中，E91532+91532體積比100∶1和1∶1處理相對(duì)酸性黃壤敏感的S.meliloti91532的占瘤率僅為7.78％和52.15％，明顯低于E91532+MA2體積比100∶1和1∶1處理耐酸S.meliloti MA2的占瘤率20.71％和68

8、.89％，而在砂壤和紫色土中，苜蓿根瘤菌91532的占瘤率和根瘤菌MA2相差不大;耐酸性研究發(fā)現(xiàn)MA2在pH4.2時(shí)依然可以生長(zhǎng)，而91512和91532的耐酸能力分別為pH5.2和pH4.8，耐酸能力較高的MA2在酸性黃壤中的占瘤率也較高，根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力與菌株的耐酸能力有關(guān)，在酸性黃壤中接種耐酸能力較高的S.meliloti MA2可以提高菌株的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力。同時(shí)菌株的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力與土壤的酸堿度相關(guān)，對(duì)酸性黃壤敏感的S.meli

9、loti91532在酸性黃壤中的占瘤率顯著低于耐酸S.meliloti MA2，而在pH偏向于中性的砂壤和紫色土中，S.meliloti91532的占瘤率和S.meliloti MA2相似，這與pH在水培條件下對(duì)根瘤菌的影響相似，水培中pH5.2的對(duì)根瘤菌定殖密度和遷移的影響較pH5.8和pH7.0大。其次菌株的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力與接種量有關(guān)，同一接種組合不同體積比的占瘤率均表現(xiàn)為100∶1＞1∶1＞1∶100，適當(dāng)增加接種量可以提高菌株的占

10、瘤率。
　　5、在黃壤、砂壤和紫色土中，接種根瘤菌處理均提高了土壤全氮、堿解氮含量，在黃壤中，接種根瘤菌E91532+91532、E91532+91512、E91532+MA2處理和不接種對(duì)照相比顯著提高了土壤堿解氮含量，分別提高了21.45％、20.28％、26.67％。接種根瘤菌E91532+MA2處理的全氮含量與對(duì)照相比有顯著差異，提高了16.06％。土壤類(lèi)型的酸堿度可以影響土壤中根瘤菌數(shù)量、微生物活性、群體感應(yīng)強(qiáng)度。同一接

11、種處理在酸性黃壤中的根瘤菌數(shù)量、微生物活性、群體感應(yīng)強(qiáng)度及結(jié)瘤數(shù)均顯著低于砂壤和紫色土;在酸性黃壤中，體積比1∶1和1∶100時(shí)，接種E91532+MA2處理土壤根瘤菌的數(shù)量、微生物活性、群體感應(yīng)水平、結(jié)瘤率和總結(jié)瘤數(shù)均高于接種E91532+91532和E91532+91512處理，接種E91532+MA2體積比1∶1和1∶100處理較接種E91532+91532和E91532+91512效果較好。在砂壤和紫色土中，體積比1∶1和1∶1

12、00時(shí)，接種E91532+MA2處理較接種E91532+91532和E91532+91512處理根部氮含量和地上部氮含量沒(méi)有顯著差異，但接種E91532+MA2處理部氮含量和地上部氮含量低于接種E91532+91532和E91532+91512處理，接種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力較強(qiáng)的MA2與苜蓿植株的共生固氮能力不高。群體感應(yīng)與其他測(cè)定指標(biāo)的相關(guān)分析表明，在酸性黃壤和紫色土中，根瘤菌的群體感應(yīng)水平與苜蓿植株總結(jié)瘤數(shù)、結(jié)瘤率、植株生物量均有顯著正相關(guān)