多色熒光微流控芯片電泳儀檢測光路設(shè)計與實現(xiàn).pdf

1、微流控芯片電泳是一種通過采用微加工技術(shù)，在基片材料上制作出電泳微流通道結(jié)構(gòu)及其它配套功能單元，以實現(xiàn)集微量樣品快速分離、準(zhǔn)確檢測于一體的高效低耗的微型電泳分析實驗系統(tǒng)。微流控芯片電泳一般以熒光標(biāo)記樣品，在電泳過程中完成分離和檢測，因此熒光檢測裝置是微流控芯片電泳系統(tǒng)的一個重要組成部分。
　　傳統(tǒng)的微流控芯片電泳熒光檢測裝置有多種不同的檢測形式，最為常見的系統(tǒng)采用落射熒光結(jié)構(gòu)，配合二向色鏡、濾色片多級分光，并以光電倍增管(PMT)作

2、為檢測傳感器，這類系統(tǒng)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)較高的信噪比與時間分辨率，但其系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，成本通常較高，尤其是當(dāng)檢測熒光波長眾多時，系統(tǒng)成本將隨熒光種類的增加成倍增加。文獻也有報道采用光柵作為色散元件，以定制加工的雪崩二極管(APD)為傳感器的檢測系統(tǒng)，雖然APD的高靈敏度能夠彌補光柵作為色散元件的低透過率，但定制加工元件的成本非常高，且加工條件苛刻，不適合相應(yīng)儀器的開發(fā)。與此同時，電荷耦合元件(CCD)作為一種越發(fā)常見的光電傳感器，正在被廣泛應(yīng)用

3、于各類檢測領(lǐng)域，高質(zhì)量CCD不僅可以用于生物領(lǐng)域的成像，也可以用于各類熒光、化學(xué)發(fā)光的檢測，但CCD靈敏度一般不及PMT、APD高。為了同時兼顧微流控芯片電泳熒光檢測系統(tǒng)的成本與檢測靈敏度，本文設(shè)計并實現(xiàn)了一套以三棱鏡作為色散元件配合CCD作為感光器件的檢測系統(tǒng)，三棱鏡的高通光率能夠彌補CCD靈敏度的不足，同時也避免了多級二向色鏡、濾光片系統(tǒng)的復(fù)雜性與高成本，有效地實現(xiàn)了多波長熒光的同步檢測分離。本文的具體研究內(nèi)容如下:
　　(1

4、)本文以三棱鏡為色散元件進行Zemax仿真，研究了不同的光線入射角以及不同的棱鏡頂角對棱鏡線色散率的影響。仿真結(jié)果顯示棱鏡入射角從0°增加至最小偏向角對應(yīng)的入射角時，線色散率減小;棱鏡頂角增加，線色散率增加，仿真結(jié)果也從理論上說明了采用棱鏡作為色散元件的可行性。
　　(2)本文設(shè)計了激光誘導(dǎo)的微流控芯片電泳多色熒光檢測光路的結(jié)構(gòu)圖，詳述了光路搭建過程中所采用的各類調(diào)試方法;調(diào)試后的系統(tǒng)能夠穩(wěn)定地獲得色散的光譜圖像;并以此為基礎(chǔ)，確

5、定選用光譜圖像中高度為35像素矩形圖像區(qū)進行光譜曲線轉(zhuǎn)換較為合適;本文同時測定了10-7 mol/L、10-8 mol/L、10-9 mol/L標(biāo)準(zhǔn)熒光素鈉樣品溶液下，采集光譜信號的信噪比(SNR)與信背比(SBR)，結(jié)果顯示當(dāng)選用0.1s曝光時間時，系統(tǒng)半峰寬SNR為20.961 dB，信背比SBR為0.438，理論上信號可用于有效的光譜分析;本文還測定了不同濃度熒光素鈉樣品溶液在當(dāng)前的激光強度下的熒光漂白情況，結(jié)果顯示低濃度的漂白情

6、況較為嚴重。
　　(3)本文選擇波長掃描法對系統(tǒng)進行了光譜標(biāo)定，實驗考察了不同的峰值定位方法與不同的標(biāo)定擬合函數(shù)的標(biāo)定效果，綜合分析了汞燈原子譜線與單色儀隨機譜線的測量誤差以及曲線擬合殘差結(jié)果，本系統(tǒng)最終選用質(zhì)心法作為峰值定位算法，并配合三階多項式進行擬合，標(biāo)定后的系統(tǒng)測量精度較高，測試偏差約0.947 nm。根據(jù)標(biāo)定的結(jié)果，結(jié)合本系統(tǒng)采集的低壓汞燈光譜曲線數(shù)據(jù)，本文計算出了系統(tǒng)在汞燈的546.074 nm譜線處的分辨率為4.59

7、7 nm，在576.960 nm與579.066 nm譜線處的分辨率為6.119 nm，理論上本系統(tǒng)能夠區(qū)分出電泳所采用的四種熒光染料。
　　(4)染料靜態(tài)實驗測試了電泳所用的四種不同染料在10-7mol/L，10-8 mol/L濃度時，系統(tǒng)采集信號的信噪比、信背比，結(jié)果顯示6-FAM染料由于熒光波長受當(dāng)前截止濾光片的影響，在本系統(tǒng)的檢測信號強度較弱。其他三種染料的信噪比與信背比一般呈現(xiàn)如下趨勢:HEX＞TAMRA＞ROX;相對于

8、熒光素鈉，三種染料的信號強度均較弱。
　　(5)本文提出了基于超定方程的最小二乘解的熒光矯正算法，用于矯正多種熒光同時經(jīng)過檢測窗口的光譜曲線，混合熒光溶液靜態(tài)實驗結(jié)果顯示該算法在不同濃度、不同曝光時間下的矯正系數(shù)與預(yù)期基本一致，矯正參數(shù)還原出的光譜擬合曲線與原始采集的光譜曲線在峰內(nèi)基本重合。
　　(6)本文進行了微流控芯片電泳實驗，驗證了三種不同染料在電泳過程中通過檢測窗口的檢測效果，實驗發(fā)現(xiàn)電泳過程中電泳膠內(nèi)含有不屬于上述