pH值調節(jié)誘導鱷蛇鯔肌球蛋白分子展開-折疊行為的研究.pdf

1、pH值調節(jié)法(pH-shifting)提取魚蛋白是魚糜生產新工藝,不僅能提高蛋白得率,在一定程度上還能改善蛋白質的功能特性,但有關其功能特性的改善與結構關系的研究還不夠系統(tǒng)深入。為此,本研究以鱷蛇鯔肌球蛋白為研究對象,從廣泛pH值條件(2.0-12.0)誘導鱷蛇鯔肌球蛋白去折疊行為入手,分析了極端酸/堿條件下不同酸、堿類型對肌球蛋白去折疊行為的影響,不同鹽濃度對酸/堿去折疊肌球蛋白的影響,最后分析了不同酸、堿類型誘導去折疊后兩種重折疊途

2、徑對肌球蛋白構象影響。本文可為pH值調節(jié)法生產魚糜工藝提供理論依據,對于認識肌球蛋白分子去折疊和重折疊構象變化,開發(fā)功能性質良好的水產蛋白具有指導作用。主要結果如下:
　　1、鱷蛇鯔肌球蛋白重鏈分子量為200 kDa,三種輕鏈分子量分別為18 kDa、22kDa和26 kDa,蛋白純度達到了97％,滿足后續(xù)試驗的要求。在等電點處,肌球蛋白的表面疏水性最小。在近中性條件下總巰基含量最高(24.9 mol/105 g和11.3 mol

3、/105 g),酸堿性條件使總巰基含量下降。在等電點 pH范圍內,肌球蛋白的表面疏水性、α-螺旋含量均小;極端酸性和堿性條件下表面疏水性與溶解性呈相同趨勢,α-螺旋含量則相反。高鹽濃度(600 mmol/L KCl)使肌球蛋白的等電點向酸性方向偏移(5.0→4.0)。酸性pH值條件下,低鹽濃度下的肌球蛋白表面疏水性高于高鹽濃度;堿性pH值條件下,出現相反的結果。堿性條件更容易產生多聚體,并且多聚體主要由肌球蛋白分子的重鏈通過二硫鍵交聯產

4、生。
　　2、對于強酸,誘導肌球蛋白疏水性大小順序為鹽酸(HA)~硫酸(SA)>磷酸(PA);對于弱酸,其順序為檸檬酸(CA)>乳酸(LA)>醋酸(AA)。不同類型的酸對色氨酸熒光影響規(guī)律變化不明顯。LA處理的肌球蛋白α-螺旋含量最低,其它各酸處理之間差異不明顯。pH=2.0時,三種有機酸(醋酸、乳酸和檸檬酸)處理的肌球蛋白總巰基含量低于三種強酸。酸的種類對肌球蛋白結構的影響與pH值有關。堿性條件下,隨著pH值的增大,肌球蛋白表面

5、疏水性和色氨酸熒光呈相反趨勢。氨水處理組表面疏水性較KOH與NaOH處理組低,α-螺旋含量及色氨酸熒光較KOH與NaOH處理組高。KOH與NaOH處理對表面疏水性、色氨酸熒光、α-螺旋含量及總巰基含量的影響差異不明顯。NaOH及KOH對肌球蛋白結構的影響不明顯。氨水使肌球蛋白變性程度最小。
　　3、在KCl濃度為0.4-0.6 mol/L范圍內,三種pH值條件下的肌球蛋白的溶解性均大于91.6%。KCl濃度大于0.6 mol/L時

6、,三種pH值條件下肌球蛋白溶解性均出現下降,其中中性及堿性條件下下降緩慢,酸性條件下幾乎不溶。在0-0.04 mol/L KCl范圍內,極端酸、堿性條件下肌球蛋白表面疏水性值大于中性(p<0.05);在鹽濃度>0.6 mol/L時,堿性及中性條件下,肌球蛋白表面疏水性均隨鹽濃度增加而增加,且堿性條件下表面疏水性小于中性。在pH值為2.0時,隨著鹽濃度增加總巰基含量有緩慢下降的趨勢。鹽濃度>0.6 mol/L時,中性條件下總巰基含量出現了

7、下降,堿性條件則緩慢上升。電泳分析表明,堿性條件下鹽濃度的增加(0-0.6 mol/L)促進了肌球蛋白大分子聚合物的形成。中性條件下,α-螺旋含量在0-0.2 mol/L KCl含量較低;中性及堿性條件下,鹽濃度>0.6 mol/L時α-螺旋含量隨鹽濃度增加而升高。微量DSC分析表明,各條件下肌球蛋白吸熱曲線在30-60 oC之間出現了兩個吸收峰,鹽濃度提高增加了第一轉變溫度。酸性條件下,鹽濃度的升高降低肌球蛋白的展開;中性及堿性條件鹽

8、濃度(>0.6 M)的升高促進肌球蛋白的展開。
　　4、不同種類酸、堿誘導的展開-重折疊展肌球蛋白,其表面疏水性高于對照,色氨酸熒光強度、總巰基含量和α-螺旋含量均低于對照(p<0.05);堿性處理的肌球蛋白表面疏水性和α-螺旋含量高于酸性處理組,色氨酸熒光強度低于酸性組,總巰基含量與酸性處理組差異不明顯(p>0.05)。檸檬酸處理組肌球蛋白的表面疏水性和α-螺旋含量高于鹽酸處理組,色氨酸熒光低于鹽酸處理組,總巰基含量與鹽酸處理組

9、差異不明顯;酸性誘導展開處理,IP重折疊處理組肌球蛋白的表面疏水性、總巰基含量和α-螺旋含量高于NP組,但色氨酸熒光強度差異不明顯。堿處理誘導肌球蛋白展開-重折疊構象與堿類型、pH值及重折疊途徑都密切相關。各pH值條件下,NaOH處理組的肌球蛋白色氨酸熒光強度高于KOH組,但α-螺旋含量低于KOH處理組。IP重折疊過程比NP處理具有更高疏水性值,更低的α-螺旋含量,但色氨酸熒光及總巰基含量差異不明顯。重折疊后的肌球蛋白熱變性溫度均低于對