桑葉多羥基生物堿動態(tài)變化規(guī)律及其糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控作用.pdf

1、桑葉是國家衛(wèi)生部公布的“食藥兩用”植物原料，含有豐富的營養(yǎng)和活性成分，具有較高的營養(yǎng)保健功效。桑葉多羥基生物堿（Mulberry leafpolyhydroxy alkaloids，MLPA）是其重要的活性成分之一，在體內(nèi)外表現(xiàn)出較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性、改善胰島素敏感性及上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（Glucose transpoters，GLUT）4的表達(dá)等作用，是國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注的一類血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控因子。本課題從桑葉多羥基生物堿主要單體D

2、NJ、Fagomine的提取工藝優(yōu)化、動態(tài)變化規(guī)律、對α-葡萄糖苷酶的抑制活性、對3T3-L1細(xì)胞糖代謝的調(diào)節(jié)等方面對桑葉多羥基生物堿的糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究，旨在為桑葉降血糖功能食品研究提供理論依據(jù)。具體的研究結(jié)果如下：
　　（1）桑葉多羥基生物堿提取工藝優(yōu)化。本章內(nèi)容以桑葉多羥基生物堿主要單體DNJ、Fagomine的提取得率為考察指標(biāo)，選取影響其提取效果的原料質(zhì)量濃度、提取時間、提取溶劑pH值等3個因素，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，

3、利用Design Expert8.0.6軟件根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法對桑葉DNJ、Fagomine的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳提取工藝條件為：提取時間35.88 min，原料質(zhì)量濃度0.06g/mL，pH5.19，DNJ的提取率0.32％，F(xiàn)agomine的提取率0.22%，在此工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到DNJ的實(shí)際得率為0.315%，F(xiàn)agomine的實(shí)際得率為0.21%。表明

4、該模型有較好的擬合性，提高了有效成分的提取率。
　　（2）品種、采收月份、成熟度對桑葉多羥基生物堿含量的影響。本章內(nèi)容主要探明桑葉多羥基生物堿主要單體DNJ、Fagomine的含量隨桑樹品種、采收月份、成熟度等因素的變化規(guī)律。通過對源于9個桑樹品種、6個采收月份、5個成熟度的桑葉樣品中的多羥基生物堿單體成分DNJ、Fagomine含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)品種對DNJ、Fagomine含量影響較大，其中廣東桑的“抗青10”DNJ平均含量水

5、平較高，達(dá)到6.02 mg/g，雞桑“紫白4”的Fagomine平均含量水平較高，達(dá)到2.50mg/g，魯桑“農(nóng)桑12”DNJ平均含量較低，為0.87 mg/g，白?！坝?”Fagomine平均含量較低，為0.31 mg/g；通過分析6個采收月份間桑葉DNJ和Fagomine含量，發(fā)現(xiàn)DNJ含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化規(guī)律，在8月份達(dá)到最高值，F(xiàn)agomine含量在8、9月份達(dá)到較高值，但其變化規(guī)律沒有DNJ的明顯；以魯?！稗r(nóng)桑12”為研

6、究對象，考察5種成熟度桑葉樣品的DNJ和Fagomine含量的變化規(guī)律，其中嫩葉中的含量最高，DNJ和Fagomine的含量分別為2.37 mg/g和1.28 mg/g，隨著葉片的老化，含量逐漸降低，降至0.89mg/g和0.47mg/g，差異達(dá)166%和172%。綜上所述，桑葉DNJ、Fagomine含量受桑樹品種、采收季節(jié)及成熟度影響較大，在桑葉的利用上，應(yīng)根據(jù)有效成分的變化規(guī)律，合理選擇品種、安排采收時間及采收成熟度，以利于桑葉資

7、源開發(fā)及臨床應(yīng)用。
　?。?）分析桑葉多羥基生物堿提取物的化學(xué)組成及其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，結(jié)果表明，桑葉多羥基生物堿提取物抑制α-葡萄糖苷酶的IC50為1.59 mg/mL，其中DNJ含量為12.37μg/mL，多糖含量為0.69 mg/mL，多酚含量為9.43μg/mL。分別測定DNJ、多糖及多酚的α-葡萄糖苷酶抑制活性，確定DNJ對α-葡萄糖苷酶的IC50為20.82μg/mL，多酚對α-葡萄糖苷酶的IC50為38.6

8、3μg/mL，多糖對α-葡萄糖苷酶的IC50為7.48 mg/mL，由此推算出DNJ、多酚、多糖對桑葉多羥基生物堿提取物抑制α-葡萄糖苷酶的貢獻(xiàn)率分別為70%、48%和10%，三種活性成分對α-葡萄糖苷酶的抑制起到協(xié)同增效的效果，其中DNJ在其中發(fā)揮著主要作用。
　?。?）初步探明桑葉DNJ基于IR-PI3K-AKT-GLUT4及ADIPO-AMPK-GLUT4兩條信號途徑的糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制。從PI3K、IR、GLUT4、AMPK、

9、ADIPO、AKt等與糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關(guān)的因子變化來研究DNJ對3T3-L1細(xì)胞糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，結(jié)果表明，從0.1μmol/L-10μmol/L的DNJ處理組均能促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖的吸收，與對照組相比具有顯著性差異（P<0.05），且呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系；采用western-blot法對參與糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關(guān)因子的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，與對照組相比，0.1-10μmol/L的DNJ能促進(jìn)胰島素受體（insulin receptor,IR）、磷

10、脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol3 kinase,PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）蛋白的上調(diào)表達(dá)，除AKt在0.1-1μmol/L時的表達(dá)增量不明顯外，IR與PI3K表達(dá)量與DNJ濃度呈顯著的量效關(guān)系，0.1-10μmol/L的DNJ能顯著促進(jìn)腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）、脂聯(lián)素（adiponectin,ADIPO）及葡萄

11、糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-4（glucose transporter4,GLUT4）的表達(dá)，ADIPO與GLUT4表達(dá)量與DNJ濃度呈顯著的量效關(guān)系；采用實(shí)時定量PCR檢測與糖穩(wěn)態(tài)相關(guān)的調(diào)控因子基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，0.1-10μmol/L的DNJ能促進(jìn)細(xì)胞IR表達(dá)的上調(diào)，且隨著DNJ濃度的升高，表達(dá)量逐漸增大，0.5-10μmol/L的DNJ能顯著促進(jìn)GLUT4表達(dá)的上調(diào)，在0.5-5μmol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系，0.1-1