MKP-1和磷酸化ERK蛋白在急性脊髓損傷大鼠模型中表達的實驗研究.pdf

1、背景： 大量研究結果表明脊髓受外傷打擊時，受傷部位的中央灰質(zhì)神經(jīng)元與白質(zhì)區(qū)內(nèi)的傳導束并不足同步受損。白質(zhì)的損傷更多的是由于繼發(fā)損傷所致，因此，如果能將損傷限制在直接受傷部位，防止繼發(fā)損傷，白質(zhì)內(nèi)的傳導束就有可能被保留下來，脊髓損傷平面以下的肌肉就有可能有功能性支配，損傷灶周圍的灰質(zhì)神經(jīng)元也可以避免進一步的喪失。而細胞凋亡是繼發(fā)性脊髓損傷的重要組成部分。繼發(fā)性脊髓損傷中出現(xiàn)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞死亡不是緣于真接損傷，而是繼發(fā)絀胞凋

2、亡的結果。 絲裂原激活貨白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)細胞內(nèi)信號傳導途徑存在于真核細胞中是由四種激酶組成的鏈式反應，其中，每種激酶都通過復雜的反應網(wǎng)絡激活下游底物激酶，從而使細胞能夠在對各種胞外刺激作出反應的同時仍能保持多樣性與特異性。MAPK通路是細胞增長有關信號刺激脊椎類動物細胞生長、增殖、分化或凋亡的細胞內(nèi)信息傳遞的交匯點和共同通路，被廣泛用于細胞信號轉(zhuǎn)導的研究。它的級聯(lián)反

3、應實際上是分三步進行的：首先是MAPKK激酶(MAFKKkinase，MKKK)磷酸化激活MAFK激酶(MAPKkinase，MKK)，后者活化后磷酸化后并激活MAPK，活化的MAPK再去激活一些轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因表達?；罨腗APK主要被其磷酸酶去磷酸化而失活，這其中絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(mitogenactivatedproteinkinasephosphatase-1，MKP-1)的作用最為重要。其中，已知p38MAPK參與了

4、神經(jīng)細胞凋亡過程中的信號轉(zhuǎn)導，其表達的強弱預示神經(jīng)絀胞的存在與否，是細胞對不同損傷的應急反應表現(xiàn)。最新的研究表明，在脊髓損傷后神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的凋亡過程中可以看到p38MAPK表達的增加，說明脊髓損傷后存在p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的改變。不僅如此，已有另一篇報道認為，興奮性毒性脊髓損傷可以引起損傷誘導的MKP-1→ELK－1→NF-kB信號級聯(lián)通路的活化以及在慢性疼痛過程發(fā)生過程中起關鍵作用受體表達在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，而阻斷這個信號傳

5、導通路則可以防止損傷誘導疼痛表達的發(fā)生。 但是目前對MKP-1參與的MAPK信號通路在急性脊髓損傷后的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的凋亡過程中所起到的作用仍然不明，因此進一步明確MKP－1蛋白在急性脊髓損傷后的活化與在細胞凋亡中的作用對于臨床上將損傷限制在直接受傷部位，防止繼發(fā)損傷，保留白質(zhì)內(nèi)的傳導束，避免損傷灶周剖的灰質(zhì)神經(jīng)元進一步的喪失具有重要意義。 目的： 探討絲裂原活化蛋白激酶(Mjtogenactivatedpro

6、teinkinase，MAPK)相關蛋白絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(mitogenactivatedproteinkinasephosphatase-1，MKP-1)利磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinases，ERK)在大鼠脊髓損傷后表達的變化及其意義。 方法： 20只SD大鼠，隨機分為實驗組及假手術對照組。實驗組采用改良Allen’S打擊法制作脊髓損傷動物模型，假

7、手術對照組同法暴露脊髓，但不損傷脊髓。2組大鼠術后12h取手術段脊髓，用蘇木精-伊紅染色觀察損傷脊髓組織病理變化；MKP-1和ERK蛋白免疫組織化學染色后，用UTHSCSAImageTools2.0圖像分析系統(tǒng)測定損傷處脊髓神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的單位而積內(nèi)陽性細胞數(shù)和陽性細胞光密度值；用Westernblot測定并用灰度值表示MKP－1和P－ERK蚩白的表達量。 結果： 1、脊髓組織形態(tài)學改變：蘇木精－伊紅染色切片光鏡下

8、見假手術組脊髓組織結構致密，細胞核圓而大、染色淺、核仁清晰。實驗組大鼠脊髓組織有較多片狀出血及大量出血壞死后形成的囊腔，組織疏松水腫，神經(jīng)細胞腫脹較明顯，部分神經(jīng)元和膠質(zhì)絀胞幾乎溶解消失。 2、脊髓損傷處神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞MKP－1和P-ERK蛋白含量的變化：假手術組脊髓神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞有MKP－1表達，實驗組大鼠脊髓組織有少量MKP-1的表達。P-ERK在實驗組脊髓膠質(zhì)細胞可見有大量表達，而假手術組卻很少表達。用UTHS

9、CSAImageTools3.0圖像分析系統(tǒng)測定損傷處脊髓神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的單位而積內(nèi)陽性細胞數(shù)和陽性細胞光密度值。 3、用Westernblot測定并用灰度值表示MKP－1和P-ERK蛋白的表達量，假手術對照組大鼠脊髓MKP－1的表達量明顯高于實驗組大鼠，而同時P-ERK蛋白表達卻要低于實驗組大鼠。(p＜0.01)。 結論： 1、本研究的結果初步證實在脊髓損傷早期，通過減少MKP-1的表達和磷酸化ERK的增

10、加，一方面使得p38MAPK表達增加，神經(jīng)細胞凋亡；另外一個方面磷酸化ERK的結果，可以將脊髓損傷的信息轉(zhuǎn)化，促進損傷后的炎癥反應和免疫反應。 2、本實驗通過對MAPK信號通路相關蛋白MKP-1和ERK的研究不但有助于從分子水平揭示炎癥和免疫反應機理，而且也為減少神經(jīng)變性，促進神經(jīng)再生，提供了實驗基礎和相應的靶分子。 3、對于進一步明確防止繼發(fā)損傷，保留白質(zhì)內(nèi)的傳導束，避免損傷灶周圍的灰質(zhì)神經(jīng)元進一步的喪失具有一定的意義