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文檔簡介
1、目的:
糖尿?。╠iabetes mellitus DM)是一組代謝性疾病,由于胰島素分泌缺陷和/或障礙引起的以慢性高血糖為主的疾病。長期持續(xù)的高血糖和代謝紊亂,可導(dǎo)致全身組織器官損傷和功能障礙。肝臟在2型糖尿病(T2DM)的致病中有著重要的作用,作為一個靶器官,肝臟在糖尿病狀態(tài)下也會受到損害。持續(xù)的高血糖使得晚期糖基化產(chǎn)物增加,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,纖維化增加,肝細胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化,肝細胞炎癥增加,細胞凋亡加劇等一系列變化。<
2、br> 本實驗以與OLETF大鼠其同系的LETO鼠作為對照組,OLETF大鼠以及經(jīng)羅格列酮治療大鼠均為實驗組,觀察各組大鼠肝臟組織的病理改變。并測定肝臟細胞炎癥因子IL-17以及凋亡因子Bcl-xl的表達變化。進一步來探討羅格列酮對2型糖尿病OLETF大鼠肝臟組織的影響。
方法:
大鼠單籠飼養(yǎng),標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),12/12h循環(huán)光照。LETO為正常組12只,給予普通飼料喂養(yǎng),僅注射緩沖溶液。飼養(yǎng)一個月后,每兩周做一次糖
3、耐量實驗,大鼠禁食16h后灌胃給予單劑的糖(25%葡萄糖溶液1mL/100g)2.5g/kg作為進食,在給藥前及給藥后30、60、120min分別從尾靜脈取血,以血糖儀測得血糖濃度。以血糖峰值>16.7mmol/L和負荷后120min血糖>11.1mmol/L診為糖尿病,若只具備其中一個條件則為糖耐量減低。到30周時,共有16只OLETF大鼠作為實驗組模型。之后隨機分為兩組(n=8),RGZ組灌以羅格列酮稀釋液,劑量為3mg/kg·d。
4、DM組和NC組灌以等量蒸餾水,每日1次灌胃12周。
三組大鼠分別采集血液進行測量,之后三組大鼠同時處死,分別取肝臟組織。放血后以無菌器械迅速取肝臟組織3塊,其中2塊分別放入DEPC處理過的凍存管中,丟入液氮保存?zhèn)溆茫?塊置于10%的福爾馬林中,行石蠟包埋切片。之后進行組織學(xué)染色,包括:HE染色、AO染色、Schiff實驗、Masson三色染色、氯化金染色和免疫組織化學(xué)染色。觀察大鼠肝臟組織學(xué)變化、測定肝肝巨噬細胞和肝儲脂細胞數(shù)
5、量的變化、觀察肝臟組織細胞RNA變化、膠原纖維的變化以及IL-17和Bcl-xL的陽性表達改變。另外,用置于-70℃的肝臟組織制成組織勻漿來,羥脯氨酸法測定膠原蛋白的含量。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行處理。
結(jié)果:
1.大鼠一般狀況比較:與LETO大鼠相比,OLETF大鼠體型較為肥胖,神經(jīng)較為敏感易激怒,懶動畏寒,精神萎靡、焦慮,且肝臟體積明顯變大。
2.生化指標(biāo)的改變:處死大鼠之前分別測得OLE
6、TF大鼠餐后兩小時血糖,甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶以及肝指數(shù)。與NC組相比,DM組餐后兩小時血糖,甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶和肝指數(shù)指標(biāo)均有明顯升高,RZG組與DM組相比,DM組餐后兩小時血糖,甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶有顯著降低,但谷草轉(zhuǎn)氨酶無明顯差異。
3.肝臟組織學(xué)變化:NC組大鼠肝小葉規(guī)則,肝細胞索呈放射狀整齊排列,肝血竇結(jié)構(gòu)清晰,肝細胞核圓居中,胞質(zhì)均勻,沒有炎性細胞浸潤。DM組肝小葉失去正常結(jié)構(gòu),肝細胞索
7、變窄,肝血竇界限不清,肝細胞腫脹、脂肪變,壞死,偶見點狀炎性灶。RGZ肝細胞結(jié)構(gòu)尚清晰,肝細胞索結(jié)構(gòu)排列尚整齊,雖然也存在脂性空泡和炎性細胞,但較糖尿病對照組明顯減少
4.肝臟肝巨噬細胞的比較:通過觀察HE染色結(jié)果,計數(shù)各組織中肝巨噬細胞的數(shù)量,NC組肝巨噬細胞計數(shù)結(jié)果為17.05±0.89,DM組肝巨噬細胞數(shù)量為25.31±1.23,RGZ組結(jié)果為38.61±4.02。結(jié)果顯示DM組較NC組相對增多,但RGZ組肝巨噬細胞結(jié)果
8、較NC組和DM組都明顯增加(P<0.01)。
5.肝臟肝細胞糖原含量的變化:NC組肝糖原定位于胞漿,分布均勻密集,糖原顆粒染色均一呈粉紅色。DM組肝細胞腫脹、擁擠,糖原分布疏松,糖原顆粒不明顯。RGZ組肝糖原較糖尿病組密布,顆粒相對均一。測定肝細胞糖原顆?;叶?,NC組肝細胞糖原的灰度值為62.38±10.16,DM組(109.54±11.18)與NC組相比明顯增高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),RGZ組(79.36±9.98
9、)與NC組相比無統(tǒng)計學(xué)意義,與DM組相比明顯降低(P<0.05)。
6.肝臟組織RNA含量變化:吖啶橙熒光染色使正常細胞核DNA呈綠色或黃綠色均勻熒光,細胞質(zhì)和核仁的RNA染為桔黃(紅)色熒光,測定胞質(zhì)中RNA熒光染色灰度,與NC組(47.21±8.72)相比,DM組(89.84±10.71)和RGZ組(61.25±8.13)灰度值增高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),與DM組相比,RGZ組灰度值降低(P<0.05)。
10、r> 7.肝臟儲脂細胞(HSC)的觀察:肝臟儲脂細胞位于狄氏間隙和肝細胞之間,經(jīng)氯化金染色使得肝儲脂細胞呈紫褐色,背景淡灰色。通過高倍鏡下儲脂細胞計數(shù),與NC組肝儲脂細胞(2.75±0.21)相比DM組(7.19±0.45)升高(P<0.01),與DM組相比RGZ組儲脂細胞數(shù)值(4.93±0.48)降低(P<0.01)。
8.膠原纖維的變化:NC組大鼠肝小葉中央靜脈管壁薄,門管區(qū)有少量結(jié)締組織,其所占面積的百分比為[(3.1
11、9±0.75)%],與NC組相比,DM組[(15.87±0.63)%]肝小葉中央靜脈管壁增厚,門管區(qū)結(jié)締組織增多,膠原沉積(P<0.01),與DM組相比,RGZ組[(10.06±0.54)%]在門管區(qū)可見纖維間隔,較DM組膠原纖維減少(P<0.05)。
9.膠原蛋白含量的比較:高效液相色譜法測定每克肝臟組織中的膠原蛋白的含量,與NC組(64.52±21.51 mg/g)相比,DM組(134.54±18.78 mg/g)膠原蛋白
12、含量明顯增加(P<0.01),RGZ組(91.59±10.75 mg/g)低于DM組(P<0.01),有統(tǒng)計學(xué)意義。
10.肝臟組織IL-17表達變化:與NC組成肝臟IL-17陽性表達吸光度值(0.129±0.045)相比,DM組(0.520±0.021)升高(P<0.01),而RGZ組(0.235±0.034)低于DM組(P<0.01)。
11.肝臟組織Bcl-xl表達變化:與NC組肝臟組織Bcl-xL陽性表達吸光
13、度值(0.613±0.014),DM組(0.242±0.041)降低(P<0.05),RGZ組肝臟組織Bcl-xL陽性表達(0.369±0.048)較DM組升高(P<0.01)。
結(jié)論:
1.糖尿病大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝細胞腫脹,膠原纖維沉積,膠原蛋白含量明顯增加。
2.糖尿病組HSC細胞活化增生,導(dǎo)致肝膠原纖維含量增加。
3.糖尿病組肝小葉和門管區(qū)炎性細胞增多,可能與肝巨噬細胞數(shù)量增加有關(guān);過多
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