電針刺激糖尿病小鼠足三里穴(ST-36)保護胃組織ICC的機制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分:
　　第一部分:糖尿病小鼠電針模型的構(gòu)建及胃組織ICC的改變
　　目的:以糖尿病小鼠動物模型為基礎(chǔ)進一步構(gòu)建電針模型，研究電針刺激作用下糖尿病小鼠胃組織中ICC的變化。
　　方法:6-8周齡雄性C57BL/6小鼠50只，隨機分為5個組：正常組（Control）、糖尿病組（DM）、糖尿病假性電針刺激組（DM+SEA）、糖尿病電刺激低頻組（DM+LEA）和糖尿病電刺激高頻組（DM+HEA）。利用鏈脲佐

2、菌素（STZ）溶液150mg/Kg的劑量進行腹腔注射，制備糖尿病小鼠模型。電針刺激部位為小鼠雙側(cè)后肢足三里穴（ST-36）。各組刺激參數(shù)：DM+SEA組僅給予針刺，不通電流；DM+LEA組給予10Hz、連續(xù)波1-3mA電流刺激；DM+HEA組給予100Hz、連續(xù)波1-3mA電流刺激。慢性刺激，30min/天，總共刺激8周。分別在造模前1周、成模后2周、4周、6周和8周記錄各組小鼠的血糖和體重的變化。8周后取各組小鼠的胃竇和胃體組織，采用

3、新鮮組織撕片技術(shù)制備可以全層染色標(biāo)本，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀察ICC在各組中的變化。
　　結(jié)果:（1）造模前5個組小鼠血糖水平?jīng)]有明顯差異；成模后及成模后第2周、4周、6周和8周，DM組、DM+SEA組、DM+LEA組和DM+HEA組小鼠血糖水平與正常組相比顯著升高，但糖尿病小鼠各組間無明顯差異；（2）造模前各組小鼠體重沒有明顯差異；成模后第2周、4周、6周和8周，DM組、DM+SEA組、DM+LEA組和DM+HEA組小鼠體重較正

4、常組相比都有明顯下降；與DM組相比，DM+LEA組從造模后第四周開始體重下降幅度有顯著差異，DM+HEA組則從造模后第八周體重下降幅度才有明顯差異；（3）正常組胃竇和胃體組織中肌間和肌內(nèi)都可見豐富而明亮的Ano1陽性和c-Kit陽性細(xì)胞，Ano1+細(xì)胞和c-Kit+細(xì)胞幾乎可以完全重疊；與正常組相比，DM組胃竇和胃體組織肌間和肌內(nèi)Ano1和c-Kit陽性細(xì)胞均顯著減少，而DM+LEA組和DM+HEA組則未見明顯變化；在DM組和DM+SE

5、A組中，c-Kit較Ano1減少更明顯，可見部分Ano1+c-Kitlow和Ano1+c-Kit-存在。
　　結(jié)論：（1）電針刺激對糖尿病小鼠血糖變化無調(diào)控作用；（2）電針刺激可以減少糖尿病小鼠體重的下降幅度，尤其是DM+LEA效果更佳；(3)同c-Kit相比，Ano1在糖尿病模型中標(biāo)記ICC更具敏感性和特異性;（4）低頻和高頻電針刺激可以保護糖尿病小鼠胃竇和胃體組織中ICC網(wǎng)絡(luò)不被破壞。
　　第二部分:電針刺激對胃組織中m

6、SCF/Kit-ETV1信號的影響
　　目的:以糖尿病小鼠為模型，研究在電針刺激作用下，探討mSCF/Kit-ETV1信號通路是否參與電針對ICC網(wǎng)絡(luò)的保護性作用。
　　方法:應(yīng)用免疫印跡法檢測mSCF、c-Kit、ETV1蛋白表達(dá)；應(yīng)用RT-PCR檢測mSCF、c-Kit和ETV1mRNA表達(dá)；應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)c-Kit與ETV1定位ICC細(xì)胞與ETV1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:（1）Western blot結(jié)果顯示糖

7、尿病組小鼠胃竇和胃體mSCF、c-Kit及ETV1的蛋白表達(dá)量較正常組顯著降低，而糖尿病低頻刺激組和糖尿病高頻刺激組胃竇和胃體組織mSCF、c-Kit及ETV1的蛋白表達(dá)量較糖尿病組明顯增高；（2）RT-PCR結(jié)果顯示糖尿病組小鼠胃竇和胃體組織mSCF、c-Kit和ETV1的mRNA的表達(dá)量相對于正常組明顯降低，但糖尿病低頻刺激組和糖尿病高頻刺激組較糖尿病組mSCF、c-Kit和ETV1的mRNA的表達(dá)量卻顯著增高；（3）免疫熒光雙標(biāo)結(jié)

8、果顯示在正常組ETV1的表達(dá)胃竇和胃體組織肌間極為豐富，相互連接形成網(wǎng)絡(luò)，緊鄰ICC網(wǎng)絡(luò)，與之伴行并伴有部分的重疊；在肌內(nèi)ETV1表達(dá)在胃竇和胃體組織相對減少，其走形與肌細(xì)胞一致，大部分緊鄰伴隨ICC細(xì)胞的表達(dá)，可見部分重疊；在糖尿病組可見胃竇和胃體組織中肌間和肌內(nèi)伴隨ICC網(wǎng)絡(luò)的中斷、減弱和消失，ETV1也表達(dá)明顯減少，甚至局部消失；然而，在糖尿病低頻刺激組和糖尿病高頻刺激組，ETV1表達(dá)同正常對照組一樣，形成豐富而鮮亮的ETV1網(wǎng)絡(luò)

9、與完整的ICC網(wǎng)絡(luò)毗鄰，并伴有部分重疊。
　　結(jié)論:糖尿病時胃組織中mSCF、c-Kit表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致ETV1缺失，進而致使ICC網(wǎng)絡(luò)破壞；在電針刺激作用下mSCF/Kit-ETV1信號可正常激活，維持ETV1的表達(dá)，進而保護ICC網(wǎng)絡(luò)。
　　第三部分:電針刺激對胃組織中HO-1陽性M2型巨噬細(xì)胞的影響
　　目的:以電針糖尿病小鼠為動物模型，觀察HO-1陽性M2型巨噬細(xì)胞是否參與電針對胃組織中ICC網(wǎng)絡(luò)的保護性作用機制

10、
　　方法:雄性C57BL/6小鼠60只，隨機分成正常對照組（Control group）、糖尿病組（DM group）、糖尿病假性刺激組（DM+SEA group）、糖尿病低頻刺激組（DM+LEA group）和糖尿病高頻刺激組（DM+HEA group）。成功制備糖尿病模型后，給予電針刺激干預(yù)，8周后取各組小鼠胃組織和血清。應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀察HO-1陽性巨噬細(xì)胞的表達(dá)；Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測小鼠胃

11、組織HO-1和IL-10的表達(dá)情況；使用商業(yè)試劑盒評估各組血清丙二醛（MDA）的濃度；采用RT-PCR技術(shù)檢測M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg-1和CD163及M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS的表達(dá)。
　　結(jié)果:（1）同正常對照組比，F(xiàn)4/80陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量在DM組明顯增加；與DM組相比，DM+LEA組和DM+HEA組F4/80陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少。（2）HO-1陽性M2型巨噬細(xì)胞在正常對照組、DM組及DM+SEA組幾乎無表達(dá)，但在D

12、M+LEA組和DM+HEA組表達(dá)明顯增加。（3）Western blot結(jié)果顯示正常對照組、DM組及DM+SEA組HO-1和IL-10蛋白表達(dá)較低，而在DM+LEA組和DM+HEA組表達(dá)較高。（4）RT-PCR結(jié)果顯示正常對照組、DM組及DM+SEA組HO-1和IL-10mRNA表達(dá)較低，而在DM+LEA組和DM+HEA組表達(dá)較高。（5）跟正常對照組相比，DM組血清MDA水平可見明顯升高，而DM+LEA組和DM+HEA組血清MDA水平較