自噬相關(guān)候選蛋白的差異表達證和候選蛋白之一Hint2功能的初步探索.pdf

1、目的：
　　 自噬是真核細胞中的一種保守的代謝信號通路。目前已經(jīng)知道自噬與腫瘤、感染、免疫、心血管疾病等密切相關(guān)，但自噬的分子機制仍不清楚。繼續(xù)鑒定更多的自噬相關(guān)蛋白對于進一步闡明自噬的分子機制具有重要意義。本課題前期實驗通過雙向電泳結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定出了若干個細胞自噬前后表達量有差異的蛋白質(zhì)，其中發(fā)現(xiàn)果糖二磷酸醛縮酶A(Fructose-1，6-bisphosphateAldolase，ALDOA)、組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白

2、2(Histidinetriadnucleotidebindingprotein2，HINT-2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogenase，GAPDH)和ATP合成酶O亞基(ATPsynthasesubunitO，ATP5O)四種蛋白的量在HeLa細胞發(fā)生自噬后表達量明顯降低。因此本論文的主要目的是進一步驗證這四種蛋白在自噬前后的表達差異，并根據(jù)其差異結(jié)果選擇其中的線粒體蛋

3、白HINT-2，作為研究自噬的靶蛋白，初步探索其在自噬過程中的功能。
　　 方法：
　　 1．通過Real-timequantitativePCR驗證ALDOA，HINT-2，GAPDH和ATP5O四個蛋白在饑餓前后mRNA水平的表達量的差異；
　　 2.3-MA處理細胞再行饑餓，Real-timequantitativePCR檢測四種候選蛋白mRNA水平的表達量；
　　 3．WesternBlot進一步

4、驗證HINT-2在不同自噬時相蛋白表達量的差異，初步選擇HINT-2作為進一步研究的靶蛋白；
　　 4．克隆HINT-2基因，將其插入p3xFLAG-CMV-9質(zhì)粒，構(gòu)建真核表達載體p3xFLAG-HINT-2，并用酶切、菌落PCR及測序鑒定所構(gòu)建的重組載體；
　　 5．用羅氏FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒p3xFLAG-HINT-2及其對照空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HeLa細胞內(nèi)，并以G418(1mg/ml)篩選穩(wěn)定表達FLA

5、G-HINT-2的細胞株FLAG-HINT-2-HeLa;
　　 6．以PCR檢測Neo基因，并以WesternBlot法檢測HINT-2蛋白表達水平，來驗證篩選得到的過表達FLAG-HINT-2-HeLa細胞株；
　　 7．設(shè)計并合成三條HINT-2基因RNAi干擾片段，順轉(zhuǎn)至HeLa細胞，篩選沉默效果較好的片段，為后續(xù)構(gòu)建穩(wěn)定低表達細胞模型提供條件；
　　 8．為了給后續(xù)自噬相關(guān)的功能研究提供有利的細胞模型，

6、我們用前期工作中已經(jīng)構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒peGFP-LC3轉(zhuǎn)染HeLa細胞，并以G418篩選穩(wěn)定表達GFP-LC3的GFP-LC3-HeLa細胞株；
　　 9．采用所獲得的GFP-LC3-HeLa細胞株，以GFP標簽的LC3表達變化情況作為指示，激光共聚焦下觀察不同濃度（200nM，500nM，1uM）雷帕霉素(Rapamycin)作用不同時間(1hr，2hr，3hr，4hr)，HeLa細胞內(nèi)熒光顆粒的亮度及大小，從而篩選雷帕霉素

7、誘導(dǎo)自噬的最適條件。
　　 10.為了獲得更多的自噬相關(guān)蛋白質(zhì)信息，采用饑餓法（以HBSS代替培養(yǎng)基）誘導(dǎo)HeLa細胞產(chǎn)生自噬；用蔗糖梯度離心法粗提正常組與自噬組HeLa細胞線粒體蛋白；再通過雙向電泳(pH3-10，NL)分離自噬組與正常組線粒體蛋白質(zhì)，并用考馬斯亮藍染色；最后利用PDQuest軟件分析雙向圖譜，篩選出表達有差異蛋白點。
　　 結(jié)果：
　　 1．前期雙向電泳結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜實驗結(jié)果顯示：ALDOA,H

8、INT-2GAPDH和ATP5O這四個候選蛋白在饑餓處理的HeLa細胞中表達量下降。為了進一步驗證前期實驗的結(jié)果，我們又設(shè)計了特異性引物，通過定量PCR檢測這四種蛋白mRNA水平的表達差異，發(fā)現(xiàn)這四種蛋白的mRNA水平較未處理正常細胞明顯下降；而以自噬抑制劑3-MA處理過的細胞在同樣的饑餓條件下這幾個基因的mRNA水平則與對照無差異。
　　 2．WesternBlot與Real-timequantitativePCR對HINT-

9、2的驗證結(jié)果表明：HINT-2的表達量在饑餓誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬時在mRNA水平與蛋白水平表達均下調(diào)。
　　 3．為進一步研究自噬相關(guān)線粒體蛋白HINT-2的功能，我們構(gòu)建了真核表達載體p3xFLAG-HINT-2，經(jīng)菌落PCR、酶切及測序鑒定證實載體構(gòu)建成功。
　　 4．篩選了穩(wěn)定表達FLAG-HINT-2的FLAG-HINT-2-HeLa細胞株，為后續(xù)研究HINT-2過表達狀態(tài)下線粒體自噬打下了基礎(chǔ)。
　　 5．

10、篩選出兩條沉默效果較好的HINT-2基因RNAi干擾片段，將為后續(xù)構(gòu)建穩(wěn)定低表達細胞模型提供有利條件。
　　 6．獲得了穩(wěn)定表達自噬標記蛋白GFP-LC3的GFP-LC3-HeLa細胞株，為自噬有關(guān)蛋白的功能研究提供了良好的實驗?zāi)Ｐ图毎?br>　　 7．以GFP-LC3-HeLa細胞為材料摸索了Rapamycin誘導(dǎo)自噬的最適條件，結(jié)果顯示200uM的Rapamycin作用2hr后，GFP-LC3-HeLa細胞中已出現(xiàn)明顯集

11、中的自噬泡，表明此條件下即可獲得明顯的自噬效果。
　　 8．在利用雙向電泳結(jié)合考馬斯亮藍染色進一步篩選自噬相關(guān)候選蛋白的實驗中，我們的結(jié)果顯示考馬斯亮藍染色得到的蛋白質(zhì)點數(shù)少于銀染結(jié)果，但二者得到的蛋白質(zhì)點分布模式有些不同，因此提高蛋白上樣量應(yīng)當可得到一些不同于銀染所得的差異自噬相關(guān)蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)論：
　　 雙向電泳提示：饑餓誘導(dǎo)后的HeLa細胞內(nèi)四種候選蛋白表達量較正常對照組下調(diào)均超過50％，而Real-t

12、imequantitativePCR驗證發(fā)現(xiàn)四種候選自噬相關(guān)蛋白質(zhì)ALDOA,GAPDH，ATP5O和HINT-2饑餓后在mRNA水平上表達較對照下降30％左右，這說明，這幾種蛋白在蛋白質(zhì)水平的變化至少部分是由于其轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化而引起的。
　　 由于饑餓導(dǎo)致的能量缺乏是引起自噬的重要原因，而線粒體是細胞能量代謝的主要細胞器，因此我們選定線粒體蛋白HINT-2作為進行進一步研究自噬發(fā)生機制的靶向蛋白。為此我們構(gòu)建了真核表達載體

13、p3xFLAG-HINT-2，并轉(zhuǎn)染至HeLa細胞中，并以G418篩選出若干株穩(wěn)定表達的FLAG-HINT-2-HeLa細胞株。經(jīng)由Neo基因擴增和WesternBlot驗證，獲得了兩株穩(wěn)定過表達HINT-2的細胞。為了給自噬有關(guān)的機制研究提供有利的實驗?zāi)Ｐ?，我們建立了穩(wěn)定表達自噬標記蛋白LC3并攜帶GFP標簽的GFP-LC3-HeLa細胞株，且采用這個細胞摸索了另一種自噬誘導(dǎo)方法Rapamycin誘導(dǎo)的適宜條件。這些實驗為后續(xù)進一步研