多氯聯(lián)苯污染環(huán)境樣品中非可培養(yǎng)狀態(tài)菌的復(fù)蘇及形成機(jī)理研究.pdf

1、活的但非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)是微生物應(yīng)對(duì)各種環(huán)境壓力的一種生存機(jī)制。藤黃球菌等微生物的復(fù)蘇促進(jìn)因子(resuscitation-promoting factor，Rpf)可將VBNC狀態(tài)菌復(fù)蘇。目前關(guān)于VBNC菌及其復(fù)蘇研究主要集中在病原菌及流行病學(xué)領(lǐng)域。有機(jī)異生質(zhì)污染土壤、底泥等環(huán)境中大量微生物受脅迫處于VBNC狀態(tài)，對(duì)其進(jìn)行復(fù)蘇研究，有望提高有機(jī)污染物微生物降解修復(fù)能力，獲得高效

2、降解新種資源，并有助于揭示微生物VBNC誘導(dǎo)及其復(fù)蘇機(jī)理。本研究通過(guò)響應(yīng)面分析法(response surfacemethodology, RSM)優(yōu)化藤黃球菌含Rpf胞外分泌物(extracellular organic matter，EOM)的蛋白產(chǎn)量;以多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)污染土壤或底泥為富集源，研究藤黃球菌EOM對(duì)富集培養(yǎng)體中菌體生長(zhǎng)、聯(lián)苯降解性能、菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的影響;同時(shí)

3、分離培養(yǎng)、鑒定EOM添加組特有的菌株，選擇聯(lián)苯(biphenyl，BP)/PCBs降解性能最高的菌株進(jìn)行多相分類(lèi)鑒定，確定其新種分類(lèi)地位;并通過(guò)低溫和貧營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)新種菌株進(jìn)入VBNC狀態(tài)，研究其形態(tài)、酶活性及基因轉(zhuǎn)錄水平方面的變化，以期揭示VBNC狀態(tài)的形成機(jī)理。研究主要結(jié)果如下:
　　(1)采用PBD（Plackett-Burman Design）設(shè)計(jì)法以蛋白產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo)，從培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件中篩選出4個(gè)顯著因素。然后采用中心

4、組合設(shè)計(jì)(centralcomposite design，CCD)響應(yīng)面分析法獲得藤黃球菌EOM產(chǎn)蛋白的優(yōu)化條件:礦物鹽溶液1.5 ml/L、L-乳酸鋰鹽8.75 g/L、pH=7.5、培養(yǎng)時(shí)間48 h。EOM主成分分析表明，EOM既含有多糖又含有蛋白質(zhì)，分別為405.74和25.13 mg/L。由凝膠色譜層析結(jié)果可知，多糖主要是分子量為4422 Da的低聚糖，主要蛋白質(zhì)分子量為11489 Da和9562 Da。克隆表達(dá)所得的Rpf重組

5、蛋白分子量為45 KDa，是理論值的1.25倍。
　　(2) PCBs污染土壤或底泥來(lái)源的添加EOM的富集培養(yǎng)體，其耐受BP濃度和BP降解效率及菌群多樣性有明顯提高，菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯變化。對(duì)比EOM添加組和滅活EOM添加組可知，EOM中的蛋白質(zhì)起到關(guān)鍵作用。結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)和16S rRNA基因高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EOM顯著促進(jìn)放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）的紅球菌屬（Rhodo

6、coccus）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）的假單胞菌屬（Pseudomonas）的菌群生長(zhǎng)。同時(shí)，在被試的三組不同PCBs污染底泥樣中，EOM對(duì)PCBs濃度最高的SS3底泥樣影響最大，且Actinobacteria門(mén)的Rhodococcus屬及其它的未可培養(yǎng)菌群可能是其中被復(fù)蘇的高效降解菌群。從處理組分離的特有菌株歸屬于9個(gè)菌屬，大部分為Actinobacteria。其中Rhodococcus屬菌株TG9具有最強(qiáng)的BP/P

7、CBs降解性能，其耐受BP濃度可達(dá)3000 mg/L，菌株TG13次之，且兩者均可以降解BP開(kāi)環(huán)代謝產(chǎn)物苯甲酸。
　　(3)選擇BP/PCBs降解性能最強(qiáng)的菌株TG9T進(jìn)行多相分類(lèi)鑒定。結(jié)果表明，除4個(gè)模式菌株（Rhodococcus gordoniae DSM44689T、Rhodococcuspyridinivorans DSM44555T、 Rhodococcus rhodochrous DSM43241T和Rhodococ

8、cus artemisiae DSM45380T）外，菌株TG9T與其它菌株16S rRNA基因序列相似性均低于98％。且菌株TG9T與4個(gè)模式菌株在生長(zhǎng)溫度范圍、pH范圍、鹽濃度范圍、碳源利用、氮源利用、產(chǎn)酸底物、底物水解和抗生素敏感等表型特征上存在差異。同時(shí)，它具有以下化學(xué)分類(lèi)特征:屬于典型的細(xì)胞壁Ⅳ型細(xì)菌，脂肪酸主要組分為C16∶0，細(xì)胞極性脂組分包括磷脂、糖脂和未確定極性脂，甲基萘醌MK-8(H2)是唯一的醌組分，且細(xì)胞中存在枝

9、菌酸甲基脂組分。另外，它的G+C含量為62.8 mol％，且與4個(gè)模式菌株DNA-DNA同源性均低于50％?；诰闠G9T的表型、化學(xué)分類(lèi)及基因型特征分析可知，它與4個(gè)模式菌株存在差異，因此，確定菌株TG9T的新種分類(lèi)地位，命名為Rhodococcusbiphenylivorans（嗜聯(lián)苯紅球菌）。
　　(4)將菌株R.biphenylivorans TG9T在低溫和貧營(yíng)養(yǎng)條件下進(jìn)行VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)。結(jié)果表明，145 d后其可培

10、養(yǎng)數(shù)降低至0.1 CFU/mL，即進(jìn)入VBNC狀態(tài)。將VBNC狀態(tài)菌懸液涂布于LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3d后即恢復(fù)可培養(yǎng)狀態(tài)。由形態(tài)及酶活分析可知，VBNC細(xì)胞呈現(xiàn)萎縮，明顯小于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，且熒光強(qiáng)度也明顯減弱。復(fù)蘇細(xì)胞的大小和熒光強(qiáng)度均介于VBNC細(xì)胞和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞之間。同時(shí)，三種細(xì)胞均具有API ZYM試劑盒19種酶中的8種酶活性，而在VBNC細(xì)胞中的活性低于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

11、表明，VBNC細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞相比共有2097個(gè)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，上調(diào)和下調(diào)基因分別為1452和645個(gè)，雖然上調(diào)基因要多于下調(diào)基因，但是差異倍數(shù)在20倍以上的上調(diào)和下調(diào)基因分別為17和42個(gè)。綜合GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes)代謝途徑富集分析可知，進(jìn)入VBNC狀態(tài)后

12、，其上調(diào)基因主要涉及ATP積累(ATP accumulation)、蛋白修飾(protein modification)、肽聚糖合成(peptidoglycan biosynthesis)和RNA聚合酶(RNA polymerase)。下調(diào)基因主要與氧化還原過(guò)程(oxidation-reduction process)和氨基酸代謝(amino acidmetabolism)相關(guān)。
　　綜上所述，本論文研究結(jié)果為探索新的異生質(zhì)高效降