載VCM—SOL緩釋系統(tǒng)人工股骨頭的研制及生物毒性評估.pdf

1、背景
　　 人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染的治療十分棘手,臨床流行的治療方法，無論是全身大劑量、聯(lián)合使用抗生素，還是一、二期翻修手術(shù)，雖然可清除大部分細(xì)菌，卻均因為抗生素不能突破細(xì)菌在人工髖關(guān)節(jié)假體表面形成的生物被膜，難以徹底殺菌。常用的含抗生素骨水泥由于在假體局部、內(nèi)在釋抗放生素，取得了一定效果，但是抗生素骨水泥的有效釋放時間短、效價低、效果不穩(wěn)定、難吸收、對年輕和骨質(zhì)較好者不合適等缺陷限制了其發(fā)展。目前國內(nèi)、外的研究聚焦在一、二期的

2、人工髖關(guān)節(jié)翻修手術(shù)和局部載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)方面。
　　 硅溶膠是目前一種新型的載體材料，具有多孔的、可吸收的物理特性，生物毒性好，對組織和細(xì)胞的反應(yīng)與它的表面特性、降解率、以及與抗生素的合成有緊密關(guān)聯(lián)。相關(guān)體外實(shí)驗已證實(shí)硅溶膠具有極好的降解及控釋特性，釋放出來的抗生素抗菌性能可以得到保持。它也可被制作成片狀，顆粒狀，細(xì)粉狀，能作為內(nèi)植物的負(fù)載材料，也可以作為一種注射材料使用。國外學(xué)者Shula Radin在與Tiffan

3、y Chen的合作中,通過體外實(shí)驗觀察,證實(shí)了在室溫條件下,由硅溶膠負(fù)載的萬古霉素具有釋放緩慢,作用持久的作用,通過不同濃度配比研究，證實(shí)了硅溶膠作為一種抗生素負(fù)載材料，其降解和控釋的特性可以通過對硅溶膠的加工參數(shù)和抗生素與硅溶膠的濃度之比進(jìn)行調(diào)控，而達(dá)到臨床治療的需要。將抗生素藥物載體緩釋系統(tǒng)與人工髖關(guān)節(jié)假體相結(jié)合，從而使抗生素在局部得到釋放，達(dá)到殺菌、抑菌的目的，可能是未來假體置換術(shù)后預(yù)防感染的發(fā)展趨勢。這種特殊的抗生素假體必須做到

4、生物毒性、骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)、可塑性、緩釋性、力學(xué)強(qiáng)度的較完美結(jié)合。硅溶膠作為一種良好的抗生素藥物載體，在臨床上已經(jīng)開始得到了運(yùn)用，但在對其與抗生素藥物濃度比值和生物穩(wěn)定性方面還需近一步研究。
　　 目的
　　 1．采用正硅酸乙酯酸化水解法制備硅溶膠，以其作為藥物載體,抗生素選擇萬古霉素，制備載萬古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)；探討其體外緩釋、降解性能。確定硅溶膠與萬古霉素的濃度比例,及可注射硅溶膠-抗生素系統(tǒng)的釋放

5、時限窗口和濃度。
　　 2．載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)的體外抑菌研究，探討其在體外對金黃色葡萄球菌抑菌作用；
　　 3．載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)的生物毒性評估；
　　 4.在原我們與重慶市機(jī)電研究所鑄造醫(yī)用不銹鋼兔股骨頭的基礎(chǔ)上，將皮下給藥系統(tǒng)與其相連接，改進(jìn)成為可注射載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)鈦合金人工兔股骨頭。
　　 方法
　　 1.載萬古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的體外緩釋及降解

6、性能測定：載萬古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的制備：采用正硅酸乙酯酸化水解法制備硅溶膠(SOL)，以其作為藥物載體負(fù)載萬古霉素(VCM)，制備VCM濃度分別為10、20、30mg/ml的VCM-SOL 涂層。通過高效液相色譜方法測定VCM 體外釋放濃度，洗脫法考察涂層的體外降解行為。
　　 2.載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)的體外抑菌實(shí)驗研究：選用第一步研究中最佳載藥濃度的載萬古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)，采用溶膠

7、-凝膠法制備載VCM-SOL 涂層鈦鋼片,作為實(shí)驗組,普通鈦鋼片作為對照組。⑴、利用紅外光譜分析系統(tǒng)(FT-IR)來分析實(shí)驗組的表面基團(tuán)；⑵、選用金黃色葡萄球菌(S.A)作為試驗菌，通過細(xì)菌計數(shù)進(jìn)行洗脫液抑菌實(shí)驗；⑶、掃描電鏡檢測鈦鋼片表面細(xì)菌黏附實(shí)驗；⑷、激光掃描共聚焦觀察實(shí)驗組在體外對金黃色葡萄球菌生物膜形成抑制的作用，對比觀察實(shí)驗組和對照組的體外抗菌效果。
　　 3.載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)的生物毒性評估；⑴、生物毒性檢

8、測：根據(jù)現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886-1和醫(yī)療器械生物學(xué)評價實(shí)驗選擇指南(ISO 標(biāo)準(zhǔn)10993-1，1997)，選擇紅細(xì)胞溶血實(shí)驗、細(xì)胞毒性實(shí)驗、全身急性毒性試驗、骨內(nèi)植入實(shí)驗評價載萬古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的生物毒性。⑵、主要觀察指標(biāo)：體溫升高情況、紅細(xì)胞溶血率、胞相對增殖率及骨組織切片免疫組化。
　　 4.可注射載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)鈦合金人工兔股骨頭的研制：⑴、分別測定10只新西蘭大白兔左股骨頭直徑

9、、股骨頸長度、頸干角和股骨髓腔寬度，設(shè)計和制作普通兔人工股骨頭假體；⑵、在已設(shè)計的抗生素人工髖關(guān)節(jié)的基礎(chǔ)上，與皮下給藥系統(tǒng)相連接，設(shè)計并制作兔的可注射硅溶膠-抗生素假體。
　　 結(jié)果
　　 1.載萬古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的體外緩釋及降解性能測定結(jié)果：載藥濃度為20mg/ml的VCM-SOL 具有良好的體外釋放和降解效果，第14天時洗提液中VCM濃度為5.47±1.36μg/ml，仍高于金黃色葡萄球菌的最小

10、抑菌濃度(1.56～3.12μg/ml)，其失重率為84.72％，而第14天時載藥濃度為10mg/ml及30mg/ml的VCM-SOL 洗提液中VCM濃度分別為1.46±0.53和1.03±0.21μg/ml，失重率分別為77.39％和96.08％。
　　 2.載萬古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的體外抑菌結(jié)果：⑴、在載藥硅溶膠的FTIR 光譜圖中，SiO2和VCM的主要吸收峰都在，說明硅溶膠可以通過表面Si-OH對萬古霉

11、素產(chǎn)生有效地吸附；⑵、在104CFU和105CFU細(xì)菌濃度下,對照組的培養(yǎng)平板上都長滿了金黃色葡萄球菌,菌落數(shù)目隨金黃色葡萄球菌濃度的增加而明顯增加。而實(shí)驗組的培養(yǎng)平板上只出現(xiàn)了幾個散落的菌落, 提示在相同培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌濃度條件下，載VCM20-SOL 鈦合金鈦片的實(shí)驗組對金黃色葡萄球菌的生長有明顯的抑制作用(P<0.01)；⑶、對照組的SEM 圖顯示，大量正常結(jié)構(gòu)形態(tài)的金黃色葡萄球菌黏附，并且細(xì)菌之間相互黏連,多數(shù)聚集成團(tuán)狀;實(shí)

12、驗組表面顯示為大量棉花狀載藥涂層,黏附的細(xì)菌較為分散,大部分金黃色葡萄球菌被分解,細(xì)菌的球形結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞；實(shí)驗結(jié)果顯示實(shí)驗組對金黃色葡萄球菌的黏附同樣有著明顯的抑制作用；⑷、借助CLSM 取得了與鈦片基底平面相平行的一系列生物膜水平斷層圖像，隨著時間的推移，對照組的紅光與綠光逐漸增強(qiáng)，表明大量的細(xì)菌開始粘附于鈦片表面，慢慢形成生物膜，而實(shí)驗組中的載VCM20-SOL 鈦合金鈦片表面，僅可見散在的紅色熒光存在，且看不到明顯的綠色熒光。說

13、明了實(shí)驗組的鈦合金鈦片對金黃色葡萄球菌生物膜的形成有一定的抑制作用。
　　 3.載萬古霉素硅溶膠(VCM－SOL)緩釋系統(tǒng)的生物毒性評估結(jié)果：①抗生素釋放系統(tǒng)紅細(xì)胞溶血率為2.52％，低于陽性標(biāo)準(zhǔn)。②細(xì)胞毒性實(shí)驗：實(shí)驗組細(xì)胞相對增殖率與對照組比較無顯著性差別，毒性評分為0～1級。③骨內(nèi)植入實(shí)驗：骨組織內(nèi)抗生素緩釋系統(tǒng)可逐步降解，并逐漸被骨性組織替代，無排斥現(xiàn)象。
　　 4.根據(jù)所測股骨的各項參數(shù)，采用不銹鋼材料，制作出直

14、徑分別為7mm和8mm的兔人工骨股頭，柄長15～17mm，頸長2mm，頸干角120°。在已設(shè)計的抗生素人工髖關(guān)節(jié)的基礎(chǔ)上，設(shè)計并制作兔的可注射硅溶膠-抗生素假體，關(guān)節(jié)柄部有1個直徑1.8mm的空腔用于連接皮下給藥系統(tǒng)，周圍有10個直徑為1mm的微孔與其想通。
　　 結(jié)論
　　 1.載VCM—SOL 緩釋系統(tǒng)的制備效果滿意，具有明顯的緩釋和抑菌作用，其釋放速度和降解率可通過改變載藥濃度進(jìn)行控制；
　　 2.以硅溶膠