玉米ZmMYB59基因的克隆及功能初探.pdf

1、玉米是我國(guó)最重要的糧食作物之一，種子深播后可充分利用土壤深層水分萌發(fā)出苗。但我國(guó)現(xiàn)有品種頂土能力差，挖掘控制玉米種子頂土萌發(fā)的關(guān)鍵基因?qū)ε嘤龔?qiáng)頂土萌發(fā)能力的玉米品種具有重要意義。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)1個(gè)可能在玉米深播萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮重要作用的ZmMYB59基因。通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物在玉米中成功克隆到該基因，并對(duì)ZmMYB59基因及其啟動(dòng)子序列進(jìn)行了分析。在此基礎(chǔ)上，采用Real-Time PCR技術(shù)對(duì)該基因在不同播深、不同處理、不同萌發(fā)階段、

2、不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了系統(tǒng)分析。最后，采用葉盤(pán)法將ZmMYB59基因成功轉(zhuǎn)化到煙草中。本文主要結(jié)論如下:
　　1.從玉米自交系B73中克隆得到ZmMYB59基因，該基因包含687 bp的ORF，編碼228個(gè)氨基酸。經(jīng)多重序列對(duì)比和進(jìn)化樹(shù)親緣關(guān)系分析，ZmMYB59轉(zhuǎn)錄因子具有2個(gè)典型的MYB結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族。該基因在單子葉、雙子葉植物中均普遍存在，并且氨基酸序列相對(duì)保守。應(yīng)用perl程序取出了起始密碼子

3、前2000 bp的序列，并對(duì)這些啟動(dòng)子序列的順式作用元件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)許多與激素（特別是GA）響應(yīng)的MYB結(jié)合位點(diǎn)的元件。
　　2.Real-Time PCR分析結(jié)果表明:在胚萌發(fā)4d時(shí)，頂土能力強(qiáng)的玉米自交系B73中ZmMYB59基因的表達(dá)量隨著播深的增加而降低，而在頂土能力弱的玉米自交系X178中ZmMYB9基因的表達(dá)量隨著播深的增加呈先降低后升高的趨勢(shì)。在胚萌發(fā)6d和8d時(shí)，隨著播深的增加，B73中ZmMYB59基因在芽和根

4、中的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，而在中胚軸中的表達(dá)量則逐漸降低。此外，以標(biāo)準(zhǔn)條件下種子中ZmMYB59基因的表達(dá)量為對(duì)照發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GA3處理的種子在萌發(fā)3d后，ZmMYB59基因在中胚軸中的表達(dá)量較低，說(shuō)明GA3抑制該基因的表達(dá)。這與B73種子在深播條件下該基因的表達(dá)情況類(lèi)似。課題組前期研究結(jié)果表明，玉米種子頂土萌發(fā)主要依賴于中胚軸的伸長(zhǎng)，因此推測(cè)該基因在玉米種子頂土萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，并與GA3信號(hào)途徑有關(guān)。
　　3.將Zm MYB

5、59基因構(gòu)建到pCAMBIA3301植物表達(dá)載體中，并將重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-Bar-ZmMYB59轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，采用葉盤(pán)法進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)。在含有抗生素的培養(yǎng)基上篩選后，經(jīng)PCR鑒定獲得正常生長(zhǎng)的陽(yáng)性植株29株，表明該基因已成功轉(zhuǎn)入到煙草中。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型鑒定發(fā)現(xiàn)，在同一時(shí)間、同種營(yíng)養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比，植株較矮、葉片較窄。對(duì)ZmMYB59轉(zhuǎn)基因煙草種子在非生物脅迫下的發(fā)芽率進(jìn)行分析，結(jié)果表明，Zm