利用瘧原蟲全基因組數(shù)據(jù)和分子對接方法預(yù)測青蒿素的抗瘧靶點(diǎn).pdf

1、人類同瘧疾的斗爭已有相當(dāng)長的歷史,但瘧疾目前仍然是世界上分布和流行最廣泛的寄生蟲疾病之一。瘧原蟲耐藥性的出現(xiàn)使得許多傳統(tǒng)的抗瘧藥物如奎寧、氯喹、甲氟喹等已失去有效性。從菊科植物黃花蒿(Artemisia annua L.)中提取的抗瘧藥物青蒿素(QHS),一度被世界衛(wèi)生組織譽(yù)為“治療瘧疾的最大希望”。但青蒿素存在著半衰期短、口服利用率低及復(fù)燃率較高的缺點(diǎn),設(shè)計(jì)和合成高效低毒的青蒿素類抗瘧化合物是藥學(xué)和化學(xué)研究工作者備受關(guān)注的課題?？v觀近

2、年來,青蒿素類抗瘧新藥的研發(fā)一直處于停滯狀態(tài),其根本原因是該類衍生物的抗瘧靶點(diǎn)不明確。藥物靶點(diǎn)的確認(rèn)是發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)優(yōu)良藥物的基礎(chǔ),分子對接和生物信息學(xué)相關(guān)的理論方法可以用于靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn),并且不乏成功的實(shí)例。因此,本文主要圍繞尋找青蒿素抗瘧靶點(diǎn)這一主題進(jìn)行生物信息學(xué)研究,將有助于青蒿素類抗瘧衍生物的設(shè)計(jì)。
　　 論文第一部分綜述了國內(nèi)外的各種觀點(diǎn),討論了青蒿素衍生物的抗瘧機(jī)制。目前研究表明,青蒿素是多途徑、多靶點(diǎn)的抗瘧機(jī)制,而瘧原蟲體

3、內(nèi)的SERCA型鈣離子調(diào)節(jié)酶(pfATP6)普遍被認(rèn)為是青蒿素抗瘧作用的靶點(diǎn)。對于半胱氨酸蛋白酶(Falcipain-2,FP2)、翻譯控制腫瘤相關(guān)蛋白(TCTP)和組氨酸蛋白2(HRP2)則沒有足夠可靠的證據(jù)說明它們是青蒿素類衍生物的抗瘧靶蛋白。
　　 在論文第二部分中,我們利用同源模建、分子對接和定量構(gòu)效關(guān)系等多種方法從理論上闡明FP2、TOTP和HRP2是否為青蒿素類衍生物的抗瘧靶點(diǎn)。在進(jìn)行對接研究之前,我們首先采用同源模

4、建的方式對pfATP6和TCTP的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,并對最終模型進(jìn)行合理性評(píng)價(jià),結(jié)果令人滿意。隨后,在比較半經(jīng)驗(yàn)、從頭算法和密度泛函等五種理論方法對青蒿素配體幾何構(gòu)型優(yōu)化的基礎(chǔ)上,選用了精度和速度兼?zhèn)涞腂3LYP/6-31G*方法作為對接前配體的優(yōu)化方法。筆者還以青蒿素和已知的靶點(diǎn)pfATP6為研究體系,測試了對接算法的準(zhǔn)確性。這為下一步深入的對接和定量構(gòu)效關(guān)系研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。用Autodoek程序比較研究了青蒿素、半胱氨酸蛋白酶

5、特異性E64和脫氧青蒿素與FP2的相互作用模型,發(fā)現(xiàn)青蒿素與E64的對接模式類似,與無活性的脫氧青蒿素則截然不同。這些結(jié)果初步提示FP2可能為青蒿素的抗瘧靶點(diǎn)。采用四個(gè)系列34種有代表性的青蒿素衍生物進(jìn)一步研究與FP2形成的復(fù)合物模型。對接結(jié)果顯示,所有的配體分子都采用了比較相似的構(gòu)象與FP2結(jié)合,且結(jié)合自由能與抗瘧活性線性相關(guān)。在此基礎(chǔ)上,建立結(jié)合自由能與小分子多種描述符之間的定量構(gòu)效關(guān)系模型。QSAR模型提示,對青蒿素的取代基進(jìn)行修

6、飾使其支化度增加,可以提高抗瘧活性。另外,與FP2形成的氫鍵越多,過氧鍵所帶的電荷越負(fù),越有利于抗瘧活性的提高。分子量增大,反而會(huì)降低抗瘧活性。所得的模型不僅穩(wěn)定顯著,而且具有很好的外部預(yù)測能力。以分子對接模型為指導(dǎo),結(jié)合構(gòu)效關(guān)系的結(jié)果,確定FP2為青蒿素及其衍生物的另一抗瘧靶點(diǎn)。我們還探討了青蒿素和FP2作用的活性中間體,初步推測仲碳自由基可能為QHS-FP2酶促反應(yīng)的中間體。將青蒿素及其34種衍生物與TCTP進(jìn)行對接,配體的結(jié)合模型

7、不僅沒有表現(xiàn)出規(guī)律性,而且距離TCTP的關(guān)鍵殘基Cys14較遠(yuǎn),不存在成鍵的可能性。鑒于此,推測TCTP不是該類衍生物的抗瘧靶點(diǎn)。結(jié)論的正確性有待于進(jìn)一步的論證。另一蛋白HRP2與所有的青蒿素衍生物對接則一致結(jié)合在同一空腔內(nèi)。由于HRP2缺乏結(jié)構(gòu)方面的活性位點(diǎn)信息,這部分研究尚不完善,仍有較大探索空間。但對接研究得到青蒿素抑制HRP2的理論抑制常數(shù)與實(shí)驗(yàn)值幾乎逼近,這點(diǎn)可以說明對接方法的可信度和合理性。
　　 由于惡性瘧原蟲的全

8、基因組已經(jīng)測序完成,故本文第三部分將青蒿素的靶點(diǎn)研究擴(kuò)展到全基因組水平上,從同源蛋白和信號(hào)通路兩方面充分挖掘已有的生物信息學(xué)資源,以期獲得有價(jià)值的青蒿素抗瘧靶點(diǎn)。同源蛋白搜索、生物信息學(xué)分析和同源模建綜合運(yùn)用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),青蒿素的理論抗瘧靶點(diǎn)FP2存在著兩個(gè)高度同源蛋白FP2B和FP3。它們不僅一級(jí)序列相似,而且結(jié)構(gòu)域和三維結(jié)構(gòu)都高度保守。比較分析三個(gè)同源半胱氨酸蛋白酶與青蒿素的作用模式,發(fā)現(xiàn)青蒿素均能結(jié)合在不同受體的活性口袋,且結(jié)合作用

9、能相當(dāng)。從全基因組水平來看,青蒿素難以選擇性地抑制瘧原蟲體內(nèi)同源的三種半胱氨酸蛋白酶。由此提示,今后的青蒿素類抗瘧藥物篩選和設(shè)計(jì)要從半胱氨酸蛋白酶家族的抑制作用考慮。信號(hào)通路是生物體對外界刺激做出反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ),我們最后以信號(hào)通路為背景,探索性地研究青蒿素可能的抗瘧靶點(diǎn)和作用的信號(hào)通路。整理搜集了8種信號(hào)通路上關(guān)鍵的蛋白酶與青蒿素進(jìn)行對接,初步判斷嘌呤核苷磷酸化酶(pfPNP)、肽脫甲?；竝fPDF)和核糖-5-磷酸異構(gòu)酶(pfRp