馬鈴薯Y病毒侵染過(guò)程中煙草CLC--Nt1蛋白的功能研究.pdf

1、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)嚴(yán)重威脅茄科作物的生產(chǎn)，揭示PVY與寄主的互作關(guān)系，可為研究其致病機(jī)理及病害防治提供理論依據(jù)。前期研究發(fā)現(xiàn)普通煙(Nicotiana tabacum)編碼的氯離子通道蛋白CLC-Nt1可能與PVY編碼的6K2蛋白互作。本研究旨在通過(guò)多種生物化學(xué)與分子生物學(xué)手段，進(jìn)一步揭示CLC-Nt1蛋白在PVY侵染過(guò)程中的作用機(jī)理，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)分段克隆以及無(wú)義突變的方法構(gòu)

2、建了PVY壞死株系(Potato virus Y necrosis strain，PVYN)侵染性克隆PVY-S。該侵染性克隆可侵染本氏煙(Nicotiana benthamiana)、普通煙與番茄，并具有和野生病毒相似的致病力。在該侵染性克隆中分別插入表達(dá)了外源蛋白GFP、Rosea1及MtPsy2a，可直觀監(jiān)測(cè)PVY侵染進(jìn)程，為研究PVY的致病機(jī)理提供一個(gè)有利工具。
　　(2)通過(guò)病毒介導(dǎo)的基因沉默(virus-induced

3、 gene silencing，VIGS)、CRISPR/Cas9技術(shù)、回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)等方法證明CLC-Nt1蛋白參與植株的生長(zhǎng)發(fā)育。利用GUS染色進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析，表明CLC-Nt1基因在根、莖、葉及花中均表達(dá)。通過(guò)亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)CLC-Nt1蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與COPⅡ小泡。利用對(duì)pH敏感的熒光蛋白探針(pHluorin)，證明CLC-Nt1蛋白參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pH。利用secreted GFP(secGFP)證明CLC-Nt1蛋

4、白參與胞內(nèi)蛋白分泌途徑。
　　(3)通過(guò)酵母雙雜交(Yeast two hybrid)、共定位分析、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)等方法，證明CLC-Nt1蛋白與6K2蛋白互作。利用對(duì)pH敏感的熒光蛋白探針，發(fā)現(xiàn)PVY侵染和單獨(dú)表達(dá)6K2蛋白均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pH升高。通過(guò)病毒介導(dǎo)的基因沉默、CRISPR/Cas9技術(shù)、化學(xué)抑制劑等方法，發(fā)現(xiàn)CLC-Nt1蛋白功能缺失后PVY的胞內(nèi)復(fù)制以及系統(tǒng)侵染均受到抑制