骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響及中西醫(yī)結(jié)合治療.pdf

1、背景及目的：急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床上常見的急腹癥之一，其發(fā)病率高、臨床病理變化復(fù)雜，尤其是重癥急性胰腺炎(severe acutepancreatitis，SAP)并發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory responsesyndrome，SIRS)和多器官功能衰竭(multiple system organ failure，MSOF)時(shí)，病情發(fā)展快，死亡率高。SAP的主

2、要病理特征為胰腺組織大范圍出血性壞死，并可迅速累及鄰近周圍組織。臨床上大多數(shù)予以禁食、胃腸減壓、補(bǔ)充血容量、改善微循環(huán)、維持水電解質(zhì)平衡、血液透析、鎮(zhèn)靜、解痙、抑制胰酶分泌、激素及抗生素應(yīng)用、外科手術(shù)、中藥、營(yíng)養(yǎng)支持等綜合治療方法，盡管近幾年SAP病死率和并發(fā)癥有所下降，但目前的治療均缺乏特異有效性，很難完全逆轉(zhuǎn)病情的發(fā)展，治療效果都不甚理想。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem c

3、ells，BMSCs)具有取材方便、創(chuàng)傷性小、低免疫原性、可在體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增等特點(diǎn)。近來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明BMSCs可通過(guò)分泌一系列細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)蛋白以對(duì)抗細(xì)胞凋亡、器官纖維化和炎癥反應(yīng)，其免疫調(diào)節(jié)作用也表現(xiàn)在能夠上調(diào)具有抑制性免疫調(diào)節(jié)功能的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，從而對(duì)受損組織器官發(fā)揮保護(hù)和修復(fù)及控制炎癥反應(yīng)的功能。
　　 通過(guò)觀察同種異體BMSCs移植對(duì)SAP模型大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及炎癥因子的影響

4、，證實(shí)BMSCs在SAP時(shí)對(duì)抗炎癥反應(yīng)、保護(hù)和修復(fù)受損胰腺組織的重要作用，為BMSCs在SAP的臨床治療應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)對(duì)SAP模型大鼠進(jìn)行中西醫(yī)結(jié)合治療研究，有助于為臨床遏制急性胰腺炎病程進(jìn)展，降低SAP死亡率提供新的治療思路。
　　 方法：通過(guò)Percoll密度梯度離心法與全骨髓貼壁分離法分離、培養(yǎng)BMSCs，獲得第3代細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志CD45、CD90，同時(shí)應(yīng)用成骨、成脂肪樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法鑒定所

5、獲得的BMSCs。經(jīng)十二指腸乳頭逆行膽胰管注入1.5％脫氧膽酸鈉溶液的方法制備SAP大鼠模型。將健康SD大鼠隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組(SO)，模型組(SAP)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)治療組、大承氣湯(ZY)治療組、中西醫(yī)結(jié)合(ZXY)治療組，每組12只。BMSCs組采用同種異體BMSCs經(jīng)尾靜脈注射移植治療；ZY組采用大承氣湯灌胃治療；ZXY組采用兩種治療方法并用。通過(guò)DAPI標(biāo)記BMSCs體內(nèi)示蹤、測(cè)定血清炎癥因子IL-6與I

6、L-10含量、測(cè)定血清淀粉酶與脂肪酶含量、觀察胰腺大體解剖與組織病理學(xué)切片、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血CD4+CD25+T細(xì)胞比率等方法，分析BMSCs及中西醫(yī)結(jié)合方法對(duì)SAP大鼠的治療作用并初步探討其機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.BMSCs呈紡錘形、三角形、多角形等形態(tài)，增殖快的細(xì)胞趨向集落樣生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)逐漸均一，組份逐漸得到純化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，BMSCs細(xì)胞表面CD90呈陽(yáng)性表達(dá)約91.39%，CD

7、45呈陰性表達(dá)約99.72%；經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后茜素紅染色陽(yáng)性：成脂誘導(dǎo)分化后油紅O染色陽(yáng)性。
　　 2．模型組大鼠術(shù)后24h，開腹可見胰腺腫大，出血壞死表現(xiàn)，腹腔內(nèi)有大量血性腹水，大網(wǎng)膜處見有淺黃色皂化斑。組織病理學(xué)切片見胰腺實(shí)質(zhì)大片出血，凝固性壞死，小葉結(jié)構(gòu)模糊不清，胰腺組織間隙及實(shí)質(zhì)內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)。各治療組的各項(xiàng)指標(biāo)變化程度均明顯輕于模型組，其中ZXY組病變程度最輕。
　　 3．(1) DAPI標(biāo)記

8、的BMSCs體內(nèi)示蹤：熒光顯微鏡下可見BMSCs組胰腺冰凍切片管腔組織中有明亮藍(lán)色熒光細(xì)胞，SAP組大鼠觀察不到有明亮藍(lán)色熒光的細(xì)胞。提示BMSCs在SAP模型大鼠中能定位于受損胰腺組織。
　　 (2)血清淀粉酶與脂肪酶含量，SAP組較SO組均顯著升高(P＜0.01)；各治療組較SAP組均顯著性下降，且ZXY組下降水平最明顯(P＜0.01)。
　　 (3) SAP組大鼠血清炎癥介質(zhì)IL-6水平較SO組顯著升高(P＜0.0

9、1)，各治療組IL-6水平較SAP組均顯著下降，且ZXY組下降水平最明顯(P＜0.01)。SAP組及各治療組大鼠血清炎癥介質(zhì)IL-10水平較SO組均顯著升高(P＜0.01)，BMSCs組與ZXY組IL-10水平較SAP組均明顯升高(P＜0.05),ZY組IL-10水平較SAP組變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (4)大鼠血清CD4+CD25+T細(xì)胞百分率，SAP組較SO組顯著下降(P＜0.01)，ZY組較SA

10、P組有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，BMSCs組及ZXY組較SAP組均明顯升高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．建立了良好的BMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定方法，獲得的第3代以后的BMSCs成均一的紡錘形，純度達(dá)到90%以上；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志以及成骨、成脂肪樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化均證實(shí)所獲得的細(xì)胞符合BMSCs特性。
　　 2．通過(guò)BMSCs移植與中藥大承氣湯治療，減輕了SAP模型大鼠炎癥、腹

11、水、出血壞死等病變情況，降低了血清淀粉酶、脂肪酶與炎癥介質(zhì)IL-6的含量，與SAP組比較，各治療組抗炎細(xì)胞因子IL-10有不同程度提高，大鼠死亡率都明顯降低。通過(guò)DAPI標(biāo)記BMSCs體內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)表明BMSCs能通過(guò)血循環(huán)遷移至胰腺炎受損部位，從而參與胰腺受損組織保護(hù)與對(duì)抗胰腺炎癥反應(yīng)。SAP組外周血CD4+CD25+T細(xì)胞百分率較SO組顯著下降，BMSCs移植治療后，外周血CD4+CD25+T細(xì)胞百分率明顯提高，提示CD4+CD25+