重癥急性胰腺炎大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏及同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究共包括三大部分，每部分都通過建立SAP大鼠模型進(jìn)行研究。第一部分觀察SAP大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏現(xiàn)象；第二部分探索SAP大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏的機(jī)制；第三部分采用BMSCs進(jìn)行治療，觀察BMSCs對SAP大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏的治療效果、研究其可能的機(jī)制，為臨床尋找如何阻止SAP患者小腸毛細(xì)血管滲漏的方法提供動物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分
　　重癥急性胰腺炎大鼠小腸的毛細(xì)血管滲漏
　　目的：觀察SAP大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏

2、現(xiàn)象，研究SAP大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏的大小與時間的變化關(guān)系，及其與病變程度的關(guān)系。
　　方法：通過建立重癥急性胰腺炎大鼠模型，采用硝酸鑭電鏡示蹤、異硫氰酸熒光素標(biāo)記白蛋白等方法觀察SAP時腸道毛細(xì)血管滲漏現(xiàn)象，腸組織伊文氏藍(lán)含量測定判定SAP腸道毛細(xì)血管滲漏的大小，檢測血清及腹水的生化指標(biāo)，胰腺及小腸的病理評分。
　　結(jié)果：與假手術(shù)組相比各時間點(diǎn)SAP大鼠血清白蛋白降低、淀粉酶升高、腹水量、腹水白蛋白增多、胰腺及小腸病理評分

3、增加(p<0.001)，從6h至24h SAP大鼠血清白蛋白逐漸降低、腹水量、腹水白蛋白逐漸增多、胰腺及小腸病理評分逐漸升高(p<0.05)。SAP模型6h、12h、24h組小腸組織依文思藍(lán)含量分別為13.40±3.06ng/mg、21.88±3.75ng/mg及39.46±4.67ng/mg明顯高于假手術(shù)組5.07±1.49ng/mg、5.62±2.46ng/mg及4.90±1.76ng/mg(p<0.001)，從6h至24h小腸組織

4、依文思藍(lán)含量逐漸升高(p<0.05)。小腸毛細(xì)血管滲漏大小與小腸病理評分（r=0.93 P<0.001）、胰腺病理評分（r=0.85 P<0.001）、腹水量（r=0.78 P<0.001）及腹水白蛋白（r=0.58 P<0.001）的變化呈正相關(guān)，與血清白蛋白間的變化呈負(fù)相關(guān)（r=-0.81 P<0.001）。
　　結(jié)論：SAP時大鼠腸道毛細(xì)血管發(fā)生了滲漏，血清白蛋白降低，腹水量升高，腹水白蛋白含量上升；隨著時間的推移SAP小腸

5、毛細(xì)血管滲漏越嚴(yán)重；SAP時大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏的大小，決定了SAP小腸的病理變化程度，小腸毛細(xì)血管滲漏越明顯，小腸病理變化就越明顯；同時SAP大鼠胰腺的病變程度又影響了小腸的毛細(xì)血管滲漏大小，胰腺病理變化越明顯，小腸毛細(xì)血管滲漏越嚴(yán)重。
　　第二部分
　　重癥急性胰腺炎大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏機(jī)制探討
　　目的：探索重癥急性胰腺炎大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏機(jī)制。
　　方法：通過建立重癥急性胰腺炎模型，免疫組化、實(shí)時熒光定

6、量PCR及Western Blotting方法測定大鼠小腸組織 VASP、MMP-9基因與蛋白的改變，電鏡下觀察小腸毛細(xì)血管內(nèi)皮的改變，探索重癥急性胰腺炎小腸毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障改變的可能因素，及毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障改變對重癥急性胰腺炎小腸毛細(xì)血管滲漏的影響。
　　結(jié)果：與假手術(shù)組相比6h，12h及24h組SAP大鼠小腸組織VASP、MMP-9基因及蛋白表達(dá)明顯升高，毛細(xì)血管滲漏也相應(yīng)增加（P＜0.05）。相比12小時組，24小時組SAP

7、大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏增加，但VASP、MMP-9基因及蛋白的表達(dá)卻是降低的（P＜0.05）。免疫組化顯示12小時組小腸組織VASP、MMP-9表達(dá)最強(qiáng)。電鏡下觀察各組小腸毛細(xì)血管基底膜見腫脹、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬、部分線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹或脫顆?，F(xiàn)象，24h組可見毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜溶解等現(xiàn)象。
　　結(jié)論：SAP時釋放的各種炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素及細(xì)胞因子，通過MMP-9對毛細(xì)血管內(nèi)皮基底膜進(jìn)行降解，通過VASP介導(dǎo)的細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)

8、改變毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接與間隙，以及通過直接對毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行攻擊致其凋亡壞死，改變了SAP大鼠小腸毛細(xì)血管的內(nèi)皮屏障，通透性增加，導(dǎo)致腸道毛細(xì)血管滲漏的發(fā)生。
　　第三部分
　　同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對重癥急性胰腺炎大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏的治療
　　目的：采用BMSCs進(jìn)行治療，觀察BMSCs對SAP大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏的療效果、研究其可能的機(jī)制，為臨床尋找如何阻止SAP患者小腸毛細(xì)血管滲漏的方法提供動

9、物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：幼齡SD大鼠骨髓提取、培養(yǎng)及純化BMSCs，用于治療大鼠重癥急性胰腺炎模型，實(shí)時熒光定量PCR及Western Blotting方法測定大鼠小腸組織VASP、MMP-9基因與蛋白的改變，電鏡下觀察小腸毛細(xì)血管內(nèi)皮的改變，腸組織伊文氏藍(lán)含量測定判定治療前后毛細(xì)血管滲漏的大小，免疫組化方法了解BMSCs在腸組織的分布情況，檢測血清及腹水的生化指標(biāo)、血清IL-1β及TNF-α水平，胰腺及小腸的病理評分。
　

10、　結(jié)果：經(jīng)鑒定成功提取培養(yǎng)及純化了BMSCs，并用于治療。與模型組相比，BMSCs治療組6h，12h及24h組大鼠小腸組織VASP、MMP-9基因及蛋白表達(dá)均下降，毛細(xì)血管滲漏也相應(yīng)減小（P＜0.05）。經(jīng)BMSCs治療后各時間點(diǎn)血清IL-1β及TNF-α水平下降、血清白蛋白上升、腹水量與腹水白蛋白減少、胰腺及小腸的病理評分減?。≒＜0.05）。免疫組化觀察到在各個時間組小腸組織內(nèi)均可見到移植的BMSCs，證實(shí)移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在小

11、腸內(nèi)駐留。電鏡下觀察各組小腸毛細(xì)血管基底膜腫脹、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬、線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹或脫顆粒等現(xiàn)象與同時間點(diǎn)的SAP組好轉(zhuǎn)，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜溶解現(xiàn)象未觀察到。
　　結(jié)論：BMSCs治療通過減少SAP大鼠炎性細(xì)胞因子的釋放，以減少炎性細(xì)胞因子對內(nèi)皮細(xì)胞直接攻擊導(dǎo)致的凋亡與壞死；降低可導(dǎo)致毛細(xì)血管基底膜降解的MMP9釋放，以盡量保持毛細(xì)血管基底膜的完整性；降低可以改變毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙的VASP釋放，以調(diào)控毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)

12、胞形態(tài)改變、內(nèi)皮細(xì)胞間連接及內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜的連接，減小重癥急性胰腺炎時小腸增寬的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的間隙；以及直接分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞修補(bǔ)被破壞的毛細(xì)血管內(nèi)皮。通過上述機(jī)制來保持毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障的完整性，阻止SAP大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏的發(fā)生與發(fā)展。
　　全文小結(jié)：
　　通過建立大鼠SAP模型，從器官、組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞水平均觀察到了SAP時大鼠腸道毛細(xì)血管發(fā)生了滲漏。SAP時血清白蛋白降低，腹水量升高，腹水白蛋白含量上升

13、；隨著時間的推移SAP小腸毛細(xì)血管滲漏越嚴(yán)重；SAP時大鼠小腸毛細(xì)血管滲漏的大小，決定了SAP小腸的病理變化程度，小腸毛細(xì)血管滲漏越明顯，小腸病理變化就越明顯；同時SAP大鼠胰腺的病變程度又影響了小腸的毛細(xì)血管滲漏大小，胰腺病理變化越明顯，小腸毛細(xì)血管滲漏越嚴(yán)重。SAP時釋放的各種炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素及細(xì)胞因子，通過MMP-9對毛細(xì)血管內(nèi)皮基底膜進(jìn)行降解，通過VASP介導(dǎo)的細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)改變毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接與間隙，以及通過直接對

14、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行攻擊致其凋亡壞死，改變了SAP大鼠小腸毛細(xì)血管的內(nèi)皮屏障，通透性增加，導(dǎo)致腸道毛細(xì)血管滲漏的發(fā)生。BMSCs治療通過減少SAP大鼠炎性細(xì)胞因子的釋放，以減少炎性細(xì)胞因子對內(nèi)皮細(xì)胞直接攻擊導(dǎo)致的凋亡與壞死；降低可導(dǎo)致毛細(xì)血管基底膜降解的MMP9釋放，以盡量保持毛細(xì)血管基底膜的完整性；降低可以改變毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙的VASP釋放，以調(diào)控毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變、內(nèi)皮細(xì)胞間連接及內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜的連接，減小SAP時小腸毛