大豆Homeobox基因GmSbh1的分離、表達(dá)分析及其與種子劣變的關(guān)系.pdf

1、大豆是世界五大作物之一，也是世界上最為重要的油料作物和高蛋白糧飼兼用作物，在我國種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中發(fā)揮重要作用。南方春大豆區(qū)是我國大豆主產(chǎn)區(qū)之一，而在大豆種子生理成熟期正值南方高溫多雨季節(jié)，種子容易發(fā)生田間劣變，從而導(dǎo)致種子活力降低、產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴(yán)重制約了我國南方春大豆的發(fā)展。開展春大豆種子田間劣變機(jī)制研究是培育抗性品種、降低春大豆種子田間劣變程度和提升我國大豆產(chǎn)業(yè)市場競爭力的前提和基礎(chǔ)。同源異型盒(Homeobox，HB)基因是一類

2、在調(diào)控植物生長發(fā)育、響應(yīng)逆境脅迫和激素誘導(dǎo)等方面發(fā)揮重要功能的基因家族，GmSbh1(L13663)是大豆中被克隆的第一個(gè)HB基因。本實(shí)驗(yàn)室前期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，高溫高濕脅迫后，與對(duì)照相比，不抗田間劣變品種GmSBH1顯著上調(diào)表達(dá)，抗性品種下調(diào)表達(dá)，表明GmSBH1可能與春大豆種子田間劣變相關(guān)。以實(shí)驗(yàn)室前期研究為基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)開展以下研究:①春大豆種子田間劣變抗性的鑒定及其生理學(xué)機(jī)制;②大豆HB基因GmSbh1及其啟動(dòng)子的分離與生物信

3、息學(xué)分析;③GmSbh1在大豆不同品種、組織器官、種子發(fā)育和萌發(fā)時(shí)期以及響應(yīng)高溫高濕脅迫及激素誘導(dǎo)的表達(dá)模式;④GmSBH1的亞細(xì)胞的定位及轉(zhuǎn)錄激活活性鑒定;⑤GmSbh1過表達(dá)與植株生長發(fā)育和種子劣變的關(guān)系。通過以上研究旨在為進(jìn)一步從分子水平上闡明GmSbh1參與大豆種子田間劣變的機(jī)制，并為高抗種子田間劣春大豆品種選育奠定理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.研究了種子生理成熟期（R7期）高溫高濕[(40℃/30℃、RH100％

4、/70％、10h/14 h(晝/夜)]脅迫對(duì)寧鎮(zhèn)1號(hào)和湘豆3號(hào)植株生長、種子活力、浸種液滲漏物含量、種子營養(yǎng)成分及種皮結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，短于24 h的高溫高濕脅對(duì)2個(gè)春大豆品種豆莢和莖葉的生長量影響不明顯，脅迫超過48 h，豆莢和莖葉生長明顯受抑制，寧鎮(zhèn)1號(hào)受抑制程度較湘豆3號(hào)明顯。高溫高濕脅迫和脅迫恢復(fù)后，2品種種子生活力、發(fā)芽力以及脫氫酶和酸性磷酸酶活性呈下降趨勢;種子細(xì)胞膜透性增大，浸種液中的H+、可溶性糖和亮氨酸含量上升;種

5、皮與種臍解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，種子中脂肪和蛋白無規(guī)律性變化。短于5h的高溫高濕脅迫對(duì)春大豆種子活力的影響不明顯，脅迫超過48 h，種子活力相關(guān)指標(biāo)急劇降低。高溫高濕脅迫后，田間劣變抗性品種湘豆3號(hào)的發(fā)芽力、脫氫酶和酸性磷酸酶活性下降幅度顯著低于寧鎮(zhèn)1號(hào)，浸種液外滲量增加幅度低于寧鎮(zhèn)1號(hào)，種皮的柵狀細(xì)胞、柱狀細(xì)胞和海綿組織的致密、厚實(shí)程度以及種臍的完整性高于寧鎮(zhèn)1號(hào)，這可能是其抗田間劣變的生理學(xué)機(jī)制之一。春大豆種子田間劣變抗性鑒定的最佳條件是

6、40℃/30℃、RH100％/70％、10 h/14 h（白天/黑夜）脅迫48 h。
　　2.從大豆葉片中分離到GmSbh1的cDNA、DNA及其啟動(dòng)子序列，并對(duì)啟動(dòng)子順式作用元件、GmSbh1的氨基酸序列及其蛋白質(zhì)一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，在cDNA序列的第156～1293 bp處有一個(gè)完整的ORF，編碼379個(gè)氨基酸;GmSbh1具有HB基因家族典型的KNOX1、KNOX2、ELK和Homeodomain(

7、HD)結(jié)構(gòu)域，其DNA序列包含3個(gè)內(nèi)含子;有18條序列與GmSbh1核酸序列一致性大于80％。GmSbh1啟動(dòng)子序列包含YACT（34個(gè)）、AAAG（14個(gè)）、ARR1結(jié)合元件（11個(gè)）和AGAAA(9個(gè))等順式作用元件，有典型的TATAbox(-27)和CAATbox（-144bp），轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)位于ORF上游751 bp處。GmSBH1蛋白的分子量為42.37kDa，其中絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)和亮氨酸(Leu

8、)分別為占10％、9.8％和8.4％; GmSBH1為親水性蛋白，不具有信號(hào)肽，可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)分別在Ser（13個(gè)）、Tys（2個(gè)）和Thr上（1個(gè)）。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，GmSBH1序列存在α-螺旋（占39.31％）、β-轉(zhuǎn)角（占5.28％）、延伸鏈（占8.44％）和無規(guī)卷曲(占46.97％)，不存在跨膜螺旋。蛋白互作預(yù)測表明，GmSBH1與擬南芥中的RPL、BEL1、AT4G32980.1-P、BLH2和BLH3等蛋白的互作

9、程度較高，其中與BEL1共表達(dá)的幾率較高。
　　3.采用RT-PCR技術(shù)分析了GmSbh1在大豆不同品種、組織器官、種子發(fā)育和萌發(fā)、葉片衰老以及響應(yīng)高溫高濕脅迫及激素誘導(dǎo)的表達(dá)模式。結(jié)果表明，不同大豆品種成熟種子的GmSbh1表達(dá)量差異顯著，野生大豆表達(dá)量顯著高于栽培大豆，抗田間劣變品種高于不抗品種。2個(gè)品種組織器官表達(dá)的特異性不同，寧鎮(zhèn)1號(hào)中花的表達(dá)量極顯著高于其它器官，種子中的表達(dá)量最低;湘豆3號(hào)嫩莢中的表達(dá)量極顯著高于其它器

10、官，幼苗中的表達(dá)量最低。大豆種子發(fā)育成熟過程中GmSbh1表達(dá)量逐漸上升，生理成熟期（R7期）表達(dá)量顯著增加，完熟期（R8期）表達(dá)量最高。大豆種子萌發(fā)過程中GmSbh1表達(dá)量呈先升后降趨勢，吸脹24～48h表達(dá)量上升，隨后下降。隨著葉片的發(fā)育和衰老，GmSbh1表達(dá)呈先升后降趨勢，功能葉期表達(dá)量最高。隨著R7期高溫高濕脅迫時(shí)間的延長，種子中的GmSbh1上調(diào)表達(dá)，48h后上調(diào)的幅度顯著增大;與對(duì)照相比，不抗田間劣變品種寧鎮(zhèn)1號(hào)顯著上調(diào)表

11、達(dá)，抗性品種湘豆3號(hào)下調(diào)表達(dá)。100μM ABA處理大豆幼苗1h后，寧鎮(zhèn)1號(hào)葉片中GmSbh1的表達(dá)量極顯著升高，但隨著處理時(shí)間的延長表達(dá)幾乎沒無變化;湘豆3號(hào)葉片中GmSbh1表達(dá)量無明顯變化。100μMMeJA處理大豆幼苗1h后，寧鎮(zhèn)1號(hào)中GmSbh1顯著上調(diào)表達(dá)，隨后表達(dá)量逐漸下將;湘豆3號(hào)中，隨著MeJA處理時(shí)間的延長表達(dá)量呈逐漸上升趨勢。100μM GA3使2個(gè)品種葉片中GmSbh1的表達(dá)量均呈先升后降趨勢。20μM IAA處

12、理1h后，寧鎮(zhèn)1號(hào)GmSbh1極顯著上升，隨即下降;湘豆3號(hào)葉片的表達(dá)量一直呈下降趨勢。
　　4.采用大豆原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)GmSBH1進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，分別將包含GmSBH1全長、N-段(包含KNOX1和KNOX2)和C-段(包含ELK和HD)的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入大豆和擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體，激光共聚焦顯微掃描結(jié)果顯示，在GmSBH1-GFP和C段融合蛋白的細(xì)胞核中均能檢測到明顯的信號(hào)，表明GmSBH1為核蛋白，其核信號(hào)位于C

13、段。將GmSbh1的ORF全長和部分缺失的片段連到pGBKT7載體上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109進(jìn)行酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證GmSBH1的轉(zhuǎn)錄激活活性。結(jié)果表明，GmSBH1具有轉(zhuǎn)錄激活活性，其轉(zhuǎn)錄激活功能域位于C段的HD保守區(qū)和N段的非保守區(qū)，GmSBH1序列中的KNOX1保守域?qū)D(zhuǎn)錄激活具有抑制作用。
　　5.比較了GmSbh過表株系和野生型擬南芥株系的幼苗形態(tài)、種子活力、高溫高濕耐性、脅迫響應(yīng)基因表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，Gm

14、Sbh1參與擬南芥植株的幼苗形態(tài)建成和生長發(fā)育，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因株系的子葉狹長、葉柄變寬、真葉皺褶、根毛增多，生育期延長，簇狀花序、長角果變彎曲等。轉(zhuǎn)基因株系黃熟期的種子經(jīng)高溫高濕脅迫后(40℃，RH100％，8h)生活力顯著高于野生型，膜脂過氧化程度顯著降低。低濃度ABA下(0.5-1.0μM)，轉(zhuǎn)基因株系成苗率顯著低于野生型，幼苗生長受明顯抑制;高濃度ABA下（30-50μM），轉(zhuǎn)基因株系根系生長受抑制現(xiàn)象更明顯;100μM ABA處理