中藥對(duì)異育銀鯽CYP450的誘導(dǎo)與抑制及對(duì)恩諾沙星代謝的影響.pdf

1、以異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)為研究對(duì)象，建立異育銀鯽肝微粒體CYP1A和CYP3A活性測定方法，在此基礎(chǔ)上研究6種中藥對(duì)CYP1A和CYP3A的抑制效應(yīng)，進(jìn)一步探討了黃連素對(duì)CYP1A和CYP3A的抑制機(jī)制；同時(shí)，研究了中藥黃芩苷和甘草酸對(duì)恩諾沙星代謝的影響。本論文分為4篇，第一篇為中藥提取物對(duì)異育銀鯽肝微粒體CYP1A和CYP3A的抑制作用；第二篇是黃連素對(duì)異育銀鯽CYP4501A和3A抑制機(jī)制的探討；

2、第三篇是黃芩苷與甘草酸對(duì)恩諾沙星在異育銀鯽體內(nèi)代謝的影響；第四篇是CYP450在恩諾沙星的N-脫乙基中的作用。
　　 主要內(nèi)容如下：
　　 1.中藥對(duì)異育銀鯽肝微粒體CYP1A和CYP3A的抑制作用
　　 在建立的微粒體體系中，研究黃芩、柴胡、連翹、吳茱萸、野菊花和黃連素等6種中藥對(duì)異育銀鯽肝微粒體P450酶的影響，體外測定IC50以及相關(guān)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并推測其可能的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，孵育體系內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測

3、定，方法快捷、穩(wěn)定、靈敏度高，且6種中藥對(duì)7-乙氧基異吩唑酮-O-脫乙基酶(EROD)(CYP1A標(biāo)志酶)的抑制程度為黃連素>黃芩>連翹>野菊花>柴胡>吳茱萸，IC50依次為0.0038，0.27，2.88，7，62，16.20和16.42mg/mL，酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Vmax和Km為83.33±11.32pmol/(minmg)和3.05±0.89μM。據(jù)此計(jì)算黃連素、黃芩、連翹、野菊花、柴胡和吳茱萸的抑制常數(shù)分別為0.00028，0

4、.165，0.39，0.61，0.40和0.59mg/mL；黃連素、黃芩、連翹和吳茱萸對(duì)紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)(CYP3A標(biāo)志酶)抑制作用很弱，IC50分別為0.68，90.9，70.8和43.5mg/mL，未檢測到柴胡和野菊花對(duì)ERND有抑制作用。結(jié)果表明，這6種中藥對(duì)CYP酶的影響因亞型不同而區(qū)別較大，對(duì)CYP1A的抑制均較顯著，而對(duì)CYP3A的抑制則不明顯；同時(shí)研究它們對(duì)CYP1A的體外抑制機(jī)制，推測黃連素、黃芩、柴胡和

5、吳茱萸對(duì)EROD的抑制為競爭性抑制，野菊花和連翹則是反競爭性抑制。
　　 2.黃連素對(duì)異育銀鯽CYP4501A和3A的抑制機(jī)制研究
　　 為了深入探討中藥對(duì)P450的抑制機(jī)制，選擇黃連素，在異育銀鯽體內(nèi)從藥酶活性、蛋白量和蛋白表達(dá)水平，探討了鹽酸黃連素對(duì)CYP1A和CYP3A的抑制機(jī)制。通過單次腹腔注射不同劑量黃連素(5mg/kg，25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg)后研究異育銀鯽CYP1A和CYP3A活性

6、的變化規(guī)律，低劑量(5mg/kg)時(shí)肝微粒體的7-乙氧基異吩唑酮-O-脫乙基酶(EROD)與紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)活性相比對(duì)照組沒有變化(p>0.05)，高劑量(25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg)肝微粒體EROD與ERND活性均隨黃連素劑量增加而降低，最大劑量(100mg/kg)時(shí)分別比對(duì)照組下降了67.27％和85.83％(p<0.01)。Western-blotting表明，給藥組肝臟中CYP1A和CYP3

7、A蛋白含量隨黃連素劑量增加依次降低，CYP3A的最高劑量(100mg/kg)相比對(duì)照下降了88.6％；而CYP1A給藥各組與對(duì)照相比沒有顯著性差異(p>0.05)。定量RT-PCR結(jié)果顯示，給藥組肝臟中CYP1A和CYP3AmRNA含量隨黃連素劑量增加依次降低，最高劑量(100mg/kg)相比對(duì)照分別下降了85.0％和91.5％。由此說明黃連素對(duì)CYP1A和CYP3A的調(diào)控為抑制，但抑制機(jī)制不同，黃連素對(duì)1A的抑制主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，而

8、對(duì)3A的抑制在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平都有體現(xiàn)。通過體外孵育實(shí)驗(yàn)得出，黃連素對(duì)EROD的IC50為11.5μM，抑制動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax為0.83μM和102.04pmol/minpermgprotein，Ki為0.85μM；而在體外，黃連素對(duì)ERND的抑制作用很弱，IC50為204.3μM，筆者推測黃連素對(duì)3A的抑制作用主要發(fā)生的體內(nèi)。綜合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，筆者建議：在與由CYP1A和3A參與代謝的藥物同時(shí)使用時(shí)，應(yīng)注意到黃連素增加聯(lián)合使用藥

9、物的血藥濃度，改變其藥物代謝動(dòng)力學(xué).
　　 3.黃芩苷與甘草酸對(duì)恩諾沙星在異育銀鯽體內(nèi)代謝的影響
　　 CYP450酶是參與藥物代謝的主要的酶系，然而CYP450具有可誘導(dǎo)性，常常會(huì)被一些外源性的化學(xué)物質(zhì)(包括許多臨床常用藥物)所誘導(dǎo)，從而產(chǎn)生藥物間相互作用。本文研究了黃芩苷(Baicalin，BL)和甘草酸(Glycyrrhizin，GZ)口灌異育銀鯽后對(duì)恩諾沙星(Enrofloxacin，EF)在該動(dòng)物體內(nèi)代謝的影響

10、。異育銀鯽連續(xù)7d分別口灌BL(100mg/kg)、GZ(100mg/kg)、一組給藥后24h腹腔注射EF(10mg/kg)，采用單個(gè)動(dòng)物連續(xù)采血，HPLC測定血清EF和環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CF)濃度，分析藥動(dòng)學(xué)及其參數(shù)；另一組檢測肝微粒體CYP1A和CYP3A活性。結(jié)果表明，(1)BL和GZ對(duì)藥物EF的吸收有明顯影響，主要表現(xiàn)在峰濃度(Cmax)降低，曲線下面積(AUC)減少。(2)口灌BL和GZ后，實(shí)驗(yàn)組EF與CF

11、的AUC與t1/2z明顯小于對(duì)照組，而清除率(CL)則增大，說明BL和GZ促使EF消除加快。(3)口灌BL和GZ后，BL和GZ的CmaxCF/CmaxEF比值分別1.48％、2.22％，對(duì)照為0.95％；BL和GZ的AUCCF/AUCEF比值分別為2.16％、1.76％，而對(duì)照組為1.7％。綜合CmaxCF/CmaxEF和AUCCF/AUCEF比值可以得出，BL和GZ對(duì)EFN-脫乙基具有誘導(dǎo)作用。(4)BL和GZ組7-乙氧基異吩唑酮-O

12、-脫乙基酶(EROD，CYP1A標(biāo)志酶)和紅霉素-N-脫甲基酶(ERND，CYP3A標(biāo)志酶)活性顯著升高(p<0.05)，說明BL和GZ對(duì)CYP1A和CYP3A都有誘導(dǎo)作用。結(jié)合以上結(jié)果，推論BL和GZ加速EF的消除和其代謝產(chǎn)物CF的生成可能與其誘導(dǎo)CYP1A和CYP3A活性有關(guān)。
　　 4.CYP450在恩諾沙星的N-脫乙基中的作用
　　 通過第三篇得到CYP1A與3A的誘導(dǎo)與恩諾沙星代謝相關(guān)性較大，本文通過體內(nèi)誘導(dǎo)誘

13、導(dǎo)和體外抑制CYP450酶后，對(duì)異育銀鯽恩諾沙星N-脫乙基化代謝的影響。體內(nèi)試驗(yàn)：異育銀鯽連續(xù)7d分別口灌β-萘黃酮(BNF)(12mg/kg)和利福平(RIF)(12mg/kg)，試驗(yàn)分2組，一組為給藥后24h腹腔注射恩諾沙星(10mg/kg)，采用單個(gè)動(dòng)物連續(xù)采血，HPLC測定血漿恩諾沙星和環(huán)丙沙星濃度，分析藥動(dòng)學(xué)及其參數(shù)；另一組提取微粒體，檢測肝微粒體CYP1A和CYP3A活性；體外實(shí)驗(yàn)：微粒體與思諾沙星共同孵育，HPLC檢測EF

14、的代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的生成率，同時(shí)以酮康唑和黃連素作為陰性對(duì)照。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)口灌利福平和β-萘黃酮后，EF和CF的t1/2z和AUC均下降，而CLZ/F上升，由此可見，2種藥物均能促進(jìn)了恩諾沙星和其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在體內(nèi)的消除。(2)口灌利福平和β-萘黃酮后，代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的峰濃度分別為0.435±0.138mg/L和0.048±0.007mg/L，對(duì)照組為0.099±0.029mg/L；利福平和β-萘黃酮的AUCCF/AUCE

15、F比值分別為3.69％和1.84％，而對(duì)照組為1.76％。綜合峰濃度和AUCCF/AUCEF比值，利福平對(duì)恩諾沙星N-脫乙基化具有誘導(dǎo)作用。(3)BNF組7-乙氧基異吩唑酮-O-脫乙基酶(EROD，CYP1A標(biāo)志酶)和RIF組紅霉素-N-脫甲基酶(ERND，CYP3A標(biāo)志酶)活性顯著升高(p<0.05)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果：RIF組微粒體與恩諾沙星孵育后，環(huán)丙沙星生成率上升(p<0.05)，而將酮康唑與空白微粒體一起孵育后，環(huán)丙沙星生成率下降