葡萄雄性半不育單株的初步鑒定及相關(guān)基因的研究.pdf

1、葡萄(Vitis vinifera)是葡萄科（Vitaceae）葡萄屬(Vitis)的植物，目前選育優(yōu)質(zhì)無核葡萄新品種已經(jīng)成為葡萄育種的首要目標之一，而雄性不育是導(dǎo)致果實無核的重要遺傳因素之一，果樹上利用雄性不育作母本進行雜交可簡化育種程序，提高無核率?！娚郊t’（雄性不育）、‘魏可實生-3’、‘魏可實生-12’都是‘魏可’自交后代，是從‘魏可’（可育）葡萄自交后代中選育出來的單株，種子于2008年播種，2011、2012年發(fā)現(xiàn)‘魏可實

2、生-3’、‘魏可實生-12’在開花、結(jié)果過程中部分表現(xiàn)出類似于雄性不育的異常表現(xiàn)。
　　本實驗以‘魏可’、‘鐘山紅’以及其他兩個‘魏可’自交后代單株:‘魏可實生-3’、‘魏可實生-12’為試驗材料，對其葡萄花器官特征、花粉萌發(fā)率、花粉粒形態(tài)、成熟花粉粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及小孢子發(fā)育過程細胞學(xué)特征進行觀察，研究了葡萄半不育單株的不育特性;并采用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)分析了花藥發(fā)育相關(guān)基因的表達;采用同源克隆的方法，獲得了可能與花藥發(fā)育

3、及雄性不育相關(guān)的差異表達基因VvMYB4、VvAMS，并采用生物信息學(xué)方法對其結(jié)構(gòu)特征進行分析;對雄性不育相關(guān)基因VvMYB4轉(zhuǎn)化番茄，驗證了該基因的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.‘魏可實生-3’和‘魏可實生-12’單株的主要特征是:花絲卷曲，花絲短于花柱，花藥內(nèi)花粉量少，花粉萌發(fā)率10％左右，花藥中既有正常長球形花粉粒也有異常的近球形花粉粒;‘魏可實生-3’雙核期絨氈層未完全降解，絨氈層細胞中的營養(yǎng)物質(zhì)滯留沒有及時供應(yīng)小孢子

4、的發(fā)育，致后期部分小孢子敗育;‘魏可實生-12’絨氈層細胞在單核早期就大部分降解而導(dǎo)致營養(yǎng)供應(yīng)異常，使部分小孢子敗育。研究表明，‘魏可實生-3’的花粉敗育發(fā)生在單核晚期至雙核期，‘魏可實生-12’的花粉敗育發(fā)生在單核早期;部分藥室絨氈層的異常降解，小孢子發(fā)育營養(yǎng)供應(yīng)不均衡是導(dǎo)致‘魏可實生-3’和‘魏可實-12’花粉半不育發(fā)生的主要原因。
　　2.‘鐘山紅’AG、A6、TDF1、AMS、ACOS5、CYP71A基因表達量不足，SPL

5、基因雙核期過量表達，TDP1基因四分體時期過量表達，MYB33/6、MYB4基因過量表達，DYT1基因減數(shù)分裂期表達量不足、四分體時期至花粉成熟期過量表達，MS2基因減數(shù)分裂期過量表達、四分體時期表達量不足;‘魏可實生-3’AG、EXS、MYB4、AMS基因過量表達，SPL、A6、MYB33/65、ACOS5基因表達量不足，TPD1基因減數(shù)分裂期表達量不足，TDF1基因減數(shù)分裂期表達量不足、單核早期過量表達，DYT1、基因減數(shù)分裂期表達

6、量不足、四分體時期至花粉成熟期過量表達，MS2、CYP71A基因減數(shù)分裂期過量表達、四分體時期表達量不足;‘魏可實生-12’AG、SPL、A6、MYB33/6、AMS、ACOS5、CYP71A基因表達量不足，EXS、MYB4基因過量表達，TPD1基因減數(shù)分裂期表達量不足，TDF1基因雙核期過量表達，DYT1基因減數(shù)分裂期表達量不足、四分體時期至花粉成熟期過量表達，MS2基因減數(shù)分裂期過量表達、四分體時期表達量不足。研究表明，‘鐘山紅’、

7、‘魏可實生-3’和‘魏可實生-12’AG、EXS、SPL、TPD1基因異常表達可能影響了下游胼胝質(zhì)代謝相關(guān)基因A6、MYB33/6、TDF1基因表達，然后改變了絨氈層降解相關(guān)基因AMS、MYB4基因的表達，導(dǎo)致絨氈層降解異常，而且還影響了MS2、ACOS5、CYP71A基因表達，花粉外壁發(fā)育缺陷。
　　3.葡萄VvAMS基因，基因長2241bp，包括363bp的3'-非翻譯區(qū)，3'-UTR含有25bp的polyA結(jié)構(gòu)，開放閱讀框為

8、1878bp?！嚎伞?、‘鐘山紅’和‘魏可實生-3’VvAMS基因序列相似性為99.82％，該基因編碼625個氨基酸，該氨基酸具有AMS蛋白典型的bHLH結(jié)構(gòu)域，與可可AMS基因親緣關(guān)系最近?；蚓幋a蛋白質(zhì)的分子量為69.57KDa，等電點為4.94，與NCBI中其他植物的AMS蛋白序列相似性大于90％。該基因編碼的蛋白不合有跨膜區(qū)，不含信號肽，為親水性蛋白，α-螺旋是VvAMS蛋白的主要組成部分，β-折疊、隨機卷曲和β-轉(zhuǎn)角分布于蛋白

9、序列中。
　　4.‘魏可’、‘鐘山紅’和‘魏可實生-3’的VvMYB4基因的序列相似性為99.80％，基因編碼蛋白的相似性為99.77％，該基因在品種間相似性較高;將VvMYB4基因轉(zhuǎn)到‘Micro Tom’番茄中，經(jīng)過潮霉素篩選，獲得轉(zhuǎn)基因抗性株系，GUS瞬時表達檢測7個抗性株系，結(jié)果均呈陽性;經(jīng)過PCR檢測，5個GUS陽性株系均檢測到目的條帶;進一步RT-PCR檢測，初步證實，有4個生根株系的VvMYB4基因已經(jīng)整合到‘Mic