利用基因編碼的非天然氨基酸研究甲酸化及甲?；嚢彼岱g后修飾.pdf

1、U n i v e r s i t y o fS c i e n c e a n d T e c h n o l o g y o fC h i n aA d i s s e r t a t i o nf o rd o c t o r ’Sd e g r e eA u 曲o r ' sN a m e ：T i a n y u a n W a n gs p e c i a l i t y ： E n v i r o n m e n

2、t a lS c i e n c ea n d E n g i n e e r i n gP r o f ．R e n b i n Z h u ，P r o f ．X u e b i n Y i nF i n i s h e dt i m e ： M a y 4 山，2 0 15W Ⅳd 黜M 協(xié)甜- I 唰G 腫 №嶼№ 抓?舢Cm 響 黼 y 憐岫 ?。甿 ⅪUSK 郵例眥Sq E 乳b 臥摘要摘要近十幾年來，基于基因密碼子擴(kuò)展的非

3、天然氨基酸( u A A ) 技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。通過這項(xiàng)技術(shù)，我們可以實(shí)現(xiàn)將目標(biāo)U A A 特異性地插入到目標(biāo)蛋白的任意位點(diǎn)，其應(yīng)用范圍非常廣闊，包括原核生物一一細(xì)菌，真核生物——酵母、哺乳動物細(xì)胞、真核生物體( 如線蟲) 、高等植物( 如擬南芥) 等。利用這種方法已經(jīng)有超過i 0 0 種的U A A 被基因編碼到不同的系統(tǒng)中，利用u 從本身的性質(zhì)以及u 從與蛋白的相互作用實(shí)現(xiàn)了多種多樣的用途，如蛋白的位點(diǎn)特異性標(biāo)記，具有生物學(xué)意義

4、的核磁、紅外、F R E T 、熒光探針，改造并提高蛋白的酶活，向蛋白的特定位點(diǎn)引入翻譯后修飾研究其功能等。U A A 插入蛋白的特異性翻譯系統(tǒng)依賴于吡咯賴氨酸氨酰t N R A 合成酶( P y l R S ) 底物結(jié)合口袋對U A A 的特異性識別作用，我們將底物結(jié)合口袋的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建了P y l R S 的突變庫，通過正負(fù)篩選的策略篩選出能夠識別目標(biāo)U A A 的氨酰t R N A 合成酶，然后利用正交翻譯系統(tǒng)將U

5、A A 插入到需要研究的蛋白的特定位點(diǎn)，進(jìn)一步研究蛋白的性質(zhì)或結(jié)構(gòu)的變化。C O 。的生物固定是地球上的生命賴以生存的基礎(chǔ)，r u b i s c o 是固碳開爾文循環(huán)第一步反應(yīng)中起催化作用的酶，同時(shí)也是固碳的限速步驟。其蛋白結(jié)構(gòu)中存在一個重要的翻譯后修飾一一c a r b 鋤a t el y s i n e ( K c x ) ，起著固定并激活M 9 2 +的作用。我們首次通過U A A 的方法研究了這一翻譯后修飾的功能，并希望能夠提

6、高r u b i s c o 的酶活，進(jìn)而提高光合作用的效率，達(dá)到增加糧食產(chǎn)量的目的。首先我們設(shè)計(jì)了一系列K c x 的結(jié)構(gòu)類似物，通過引入苯酯保護(hù)或光保護(hù)的羧基保護(hù)基策略，找到了能夠識別此U A A 的P y l R S 突變體，并且成功將K c x 結(jié)構(gòu)類似物插入了r u b i s c o 蛋白的1 8 9 位點(diǎn)，以模擬K c x 的作用。結(jié)果表明含有此K c x結(jié)構(gòu)類似物的r u b i s c o 活性幾乎全部喪失，這說明K

7、c x 對于r u b i S C O 的功能是不可或缺的，其側(cè)鏈上氨基的作用可能比之前預(yù)想的更加重要。甲酰化賴氨酸是一種新的翻譯后修飾，廣泛存在于真核生物染色體的組蛋白中。這種翻譯后修飾可能對于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的調(diào)控具有重要作用，但并未得到詳細(xì)的研究，原因之一在于缺乏位點(diǎn)特異性地將甲?；嚢彼嵋胩囟ǖ鞍椎姆椒āＮ覀兪状瓮ㄟ^人工篩選的方法進(jìn)化出了能夠識別甲酰賴氨酸的P y l R S 克隆，通過基因密碼子擴(kuò)展的方法將甲酰賴氨酸引入