基于動(dòng)態(tài)表面增強(qiáng)拉曼光譜法的耐藥白色念珠菌診斷及藥物篩選研究.pdf

1、近年來(lái)，抗真菌藥物的大量濫用導(dǎo)致了真菌的耐藥現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，各類真菌普遍存在耐藥性已經(jīng)成為臨床抗真菌治療失敗的主要原因。其中，耐藥白色念珠菌引起的感染直接威脅感染者的生命。傳統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)方法包括酶聯(lián)免疫組化，分子生物學(xué)，藥敏試驗(yàn)等，需要復(fù)雜的樣品前處理，存在耗時(shí)長(zhǎng)，成本高等缺點(diǎn)，無(wú)法快速準(zhǔn)確地對(duì)耐藥白念珠菌進(jìn)行早期診斷，從而耽誤了治療。拉曼光譜，尤其是表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，具備快速、實(shí)時(shí)、無(wú)損的特點(diǎn)，在很多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。同時(shí)，不受水分

2、干擾、熒光淬滅、特征性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)使其非常適合用于生物體系的研究。因此，我們嘗試將表面增強(qiáng)拉曼光譜應(yīng)用于耐藥真菌的診斷以及抗菌藥物的篩選。本文將針對(duì)以下三個(gè)方面開(kāi)展研究，以期進(jìn)一步完善表面增強(qiáng)拉曼光譜法及其應(yīng)用，并為真菌診斷和藥物篩選提供新策略和新方法。
　　1.動(dòng)態(tài)表面增強(qiáng)拉曼光譜法的建立及參數(shù)考察
　　表面增強(qiáng)拉曼光譜法(SERS)是一種快速、實(shí)時(shí)、無(wú)損的檢測(cè)方法，由于其不受水干擾，因此十分適合生物樣品的研究。但是目前的細(xì)胞

3、檢測(cè)手段仍存在一些問(wèn)題。制備適應(yīng)特定生物細(xì)胞的SERS基底需耗費(fèi)大量的人力物力，普及性較差。而采用制備簡(jiǎn)單的廣泛使用的SERS基底納米溶膠，則存在靈敏度較低、重現(xiàn)性較差、激光對(duì)生物樣品造成破壞且檢測(cè)前等待時(shí)間較長(zhǎng)的問(wèn)題。本章針對(duì)后者對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，即引入動(dòng)態(tài)表面增強(qiáng)拉曼光譜法(D-SERS)。該法無(wú)需制備復(fù)雜的特異性基底，同時(shí)具備高靈敏、高重現(xiàn)性、水作為生物樣品的保護(hù)溶劑且在檢測(cè)前無(wú)需等待菌膠混合的大量時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，很好解決了傳統(tǒng)表面增強(qiáng)

4、拉曼光譜法中存在的問(wèn)題。本研究制備了3類SERS增強(qiáng)基底，詳細(xì)表征了各類SERS基底的結(jié)構(gòu)和特征。同時(shí)也考察了基底對(duì)白念珠菌的活性影響，綜合比較基底對(duì)細(xì)胞的活性影響與增強(qiáng)效果最終優(yōu)選出最佳的增強(qiáng)基底接下來(lái)本章詳細(xì)介紹了D-SERS的原理，并利用工具菌與優(yōu)選的SERS基底及對(duì)方法學(xué)指標(biāo)包括靈敏度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性進(jìn)行了考察，同時(shí)也進(jìn)行了詳細(xì)的真菌光譜峰歸屬分析。
　　2.動(dòng)態(tài)表面增強(qiáng)拉曼光譜法用于耐藥白色念珠菌的診斷研究
　　常

5、規(guī)診斷耐藥白色念珠菌的方法為藥敏實(shí)驗(yàn)。作為金標(biāo)準(zhǔn)方法，該法確實(shí)準(zhǔn)確性好，但耗時(shí)較長(zhǎng)通常為24h。這顯然無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的真菌感染的診治需求。如果能夠快速準(zhǔn)確的診斷出耐藥菌，這無(wú)疑具有很大的臨床意義。本章采用具有快速、指紋圖譜特征的D-SERS法用于鑒別耐藥白色念珠菌，并同時(shí)以相應(yīng)的敏感菌株作為參照（二者在外觀形態(tài)幾乎無(wú)差別）。此外，我們對(duì)采集的SERS光譜進(jìn)行了2種信息處理方法:峰比值法及化學(xué)計(jì)量學(xué)法。峰比值法幫助我們找出了區(qū)分兩類菌株

6、差異的光譜區(qū)域?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)法即PLS-DA建立了敏感和耐藥菌株的分類模型，以較高的準(zhǔn)確度區(qū)分了二者并進(jìn)行了未知菌株的預(yù)測(cè)。結(jié)果表明兩種方法均可達(dá)到快速準(zhǔn)確的診斷耐藥真菌的目的。
　　3.D-SERS法用于不同機(jī)理的抗真菌藥的分類研究
　　通常用于真菌治療的藥物篩選方法為藥敏實(shí)驗(yàn)。該方法存在耗時(shí)較長(zhǎng)的缺點(diǎn)，同樣無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的真菌感染的診療需求。如果在較短時(shí)間內(nèi)判斷出某抗菌藥的治療效果，這必定對(duì)臨床用藥具有很大的意義。本章中

7、利用D-SERS法快速地對(duì)不同機(jī)理的抗菌藥進(jìn)行了分類，并同時(shí)與各類抗菌藥的抗菌機(jī)理一一對(duì)應(yīng)。我們還利用PLS-DA法建立的模型以及留一法進(jìn)行了未知藥物機(jī)理的預(yù)測(cè)。
　　通過(guò)對(duì)上述藥物的快速篩選，我們發(fā)現(xiàn)棘白菌素類藥物具有很好的抗菌活性。此外，雖然文獻(xiàn)表明納米銀由于無(wú)耐藥性，具有良好的抗菌活性，但也會(huì)隨著各種因素的變化發(fā)生抗菌效果的改變。如果納米銀與菌細(xì)胞表面電荷存在靜電排斥，這將降低納米銀的抗菌效率。制備與菌細(xì)胞相反電荷的納米溶膠