鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)核漿癌蛋白TBC1D3的穩(wěn)定性及生物學(xué)意義.pdf

1、目的:
　　TBC1D3又稱PRC17（前列腺癌基因17），是人科特有的癌基因，高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，如前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和骨髓增生異常綜合征等。TBC1D3的表達(dá)可使正常成纖維細(xì)胞NIH3T3發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤，亦可延遲EGFR和IRS-1的降解來增強(qiáng)GFs信號，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。GFs信號負(fù)反饋調(diào)節(jié)TBC1D3的穩(wěn)定性，在E3泛素連接酶CUL7的介導(dǎo)下泛素化和降解TBC1D3，使得TBC1D3的蛋白水平

2、維持動態(tài)平衡。鈣調(diào)蛋白(CaM)參與眾多蛋白的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)，如雌激素受體α(ER-α)和TRE17/USP6等，我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示CaM通過抑制TBC1D3的降解提高其穩(wěn)定性。因此，探討CaM調(diào)節(jié)TBC1D3穩(wěn)定性的機(jī)制，將有助于闡明CaM和TBC1D3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為腫瘤的診斷和防治提供新線索。
　　方法:
　　1.為了研究CaM對TBC1D3降解的調(diào)節(jié)作用，我們轉(zhuǎn)染GST-CaM使CaM高表達(dá)或使用CaM抑制劑W7

3、抑制內(nèi)源性CaM功能，通過Western blot和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分別觀察MCF-7和BT-549細(xì)胞內(nèi)CaM對TBC1D3降解和泛素化的調(diào)節(jié)作用。通過抽提細(xì)胞漿、細(xì)胞核蛋白，觀察TBC1D3降解的亞細(xì)胞部位及CaM的調(diào)節(jié)作用。
　　2.為了探討CaM抑制TBC1D3降解的機(jī)制是否通過相互作用，以GST載體為對照，將GST-CaM和Flag-TBC1D3復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，用抗GST抗體進(jìn)行免疫共沉淀，檢測CaM與TBC1D3

4、之間的相互作用;以Flag載體為對照，將Flag-TBC1D3和GST-CaM復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，用抗Flag抗體進(jìn)行免疫共沉淀，反向檢測TBC1D3與CaM之間的相互作用;使用Ca2+螯合劑EGTA處理，通過免疫共沉淀分別觀察MCF-7和BT-549細(xì)胞內(nèi)CaM與TBC1D3的相互作用;over-lap PCR構(gòu)建TBC1D3內(nèi)在缺失突變體Flag-TBC1D3(△157-171)和Flag-TBC1D3(△303-312)，以F

5、lag為對照，分別將GST-CaM和Flag-TBC1D3及其突變體復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，抗Flag抗體做免疫共沉淀檢測它們與CaM的相互作用，以分析確定TBC1D3氨基酸序列中與CaM相互作用的功能部位;以GST載體為對照，F(xiàn)lag-TBC1D3及其突變體與GST-CaM分別復(fù)合轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，抗GST抗體做免疫共沉淀，反向驗(yàn)證TBC1D3氨基酸序列中與CaM相互作用的功能部位。
　　3.為了分析TBC1D3內(nèi)與CaM

6、結(jié)合部位的功能，用over-lap PCR構(gòu)建TBC1D3內(nèi)點(diǎn)突變體Flag-TBC1D3(Y163A-T165A)和Flag-TBC1D3(K166R)。分別轉(zhuǎn)染Flag-TBC1D3、Flag-TBC1D3(△157-171)及點(diǎn)突變體，通過Western Blot和CO-IP檢測TBC1D3及點(diǎn)突變體的降解水平和泛素化水平;以Flag為對照，將Flag-TBC1D3及點(diǎn)突變體分別和GST-CaM復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，抗Flag抗

7、體做免疫共沉淀檢測它們與CaM的相互作用。
　　4.為了檢測TBC1D3的穩(wěn)定性對細(xì)胞遷移的作用，以Flag空載體為對照，與Flag-TBC1D3分別轉(zhuǎn)染MCF-7和BT-549細(xì)胞，進(jìn)行劃痕和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。為了探討TBC1D3影響細(xì)胞遷移的機(jī)制，F(xiàn)lag空載體和Flag-TBC1D3分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，無血清饑餓24h后，明膠酶譜法檢測培養(yǎng)液內(nèi)MMP-9活性;實(shí)時熒光定量PCR和Western blot分別檢測

8、細(xì)胞裂解物內(nèi)MMP-9的mRNA和蛋白水平。復(fù)合轉(zhuǎn)染GST-CaM，觀察CaM對TBC1D3穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)作用對細(xì)胞遷移、MMP-9活性和蛋白水平的影響。
　　結(jié)果:
　　1.Western blot結(jié)果表明10％FCS可誘導(dǎo)TBC1D3降解，復(fù)合轉(zhuǎn)染CaM并高表達(dá)時，10％FCS誘導(dǎo)的TBC1D3降解受到明顯抑制，說明CaM能夠抑制TBC1D3的降解;使用W7抑制內(nèi)源性CaM功能后，TBC1D3的降解趨勢更加明顯，說明內(nèi)源性

9、CaM在TBC1D3降解中的抑制作用;免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示10％FCS可有效誘導(dǎo)TBC1D3的泛素化，CaM的表達(dá)可大大降低TBC1D3的泛素化水平，說明CaM可以降低TBC1D3的泛素化水平;細(xì)胞漿、細(xì)胞核蛋白抽提實(shí)驗(yàn)顯示在MCF-7細(xì)胞中，10％FCS刺激誘導(dǎo)TBC1D3降解既發(fā)生于細(xì)胞漿、也發(fā)生于細(xì)胞核且細(xì)胞核內(nèi)降解趨勢更加明顯;復(fù)合轉(zhuǎn)染CaM并高表達(dá)時，TBC1D3細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)降解受到明顯的抑制，均大大減少。在BT-549細(xì)胞

10、中，10％FCS刺激誘導(dǎo)的TBC1D3降解在細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)均被檢測到且細(xì)胞漿內(nèi)降解趨勢更加明顯;復(fù)合轉(zhuǎn)染CaM并高表達(dá)時，TBC1D3細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)降解均受到明顯的抑制。
　　2.用抗GST抗體進(jìn)行免疫共沉淀，GST對照組無TBC1D3結(jié)合條帶，GST-CaM組檢測到TBC1D3結(jié)合條帶，說明TBC1D3與CaM存在相互作用;以抗Flag抗體做反向免疫共沉淀，F(xiàn)lag對照組無CaM結(jié)合條帶，F(xiàn)lag-TBC1D3組檢測到CaM

11、結(jié)合條帶，說明CaM與TBC1D3存在相互作用;使用EGTA螯合Ca2+后，以抗Flag抗體或抗GST抗體做免疫共沉淀，均未檢測到TBC1D3與CaM的相互作用，提示CaM與TBC1D3的相互作用依賴于Ca2+環(huán)境。Over-lap PCR構(gòu)建的TBC1D3缺失突變體Flag-TBC1D3(△157-171)和Flag-TBC1D3(△303-312)，經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切和測序鑒定，序列正確符合預(yù)期。以抗Flag抗體或抗GS

12、T抗體做免疫共沉淀，結(jié)果均顯示157位-171位氨基酸缺失后TBC1D3不能與CaM結(jié)合，提示TBC1D3蛋白序列上與CaM相互作用的部位可能在N端的157到171位氨基酸之間。
　　3.Over-lap PCR構(gòu)建的TBC1D3點(diǎn)突變體Flag-TBC1D3(Y163A-T165A)和Flag-TBC1D3(K166R)，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切和測序鑒定，序列正確符合預(yù)期。Western blot結(jié)果顯示10％FCS可誘導(dǎo)

13、Flag-TBC1D3(Y163A-T165A)降解，而Flag-TBC1D3(△157-171)和Flag-TBC1D3(K166R)無明顯降解;以抗Flag抗體做免疫共沉淀檢測泛素水平，結(jié)果顯示Flag-TBC1D3(Y163A-T165A)與Flag-TBC1D3均檢測到明顯泛素化，F(xiàn)lag-TBC1D3(K166R)泛素水平大大降低。以抗Flag抗體做免疫共沉淀，結(jié)果顯示TBC1D3和TBC1D3(K166R)與CaM存在相互作

14、用，F(xiàn)lag對照和TBC1D3(Y163A-T165A)無CaM結(jié)合條帶，提示CaM抑制TBC1D3的降解是通過與TBC1D3相互作用抑制K166的泛素化。
　　4.細(xì)胞劃痕和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Flag-TBC1D3的MCF-7和BT-549細(xì)胞遷移能力明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染Flag空載體;實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示TBC1D3可上調(diào)MMP-9mRNA水平，Western blot檢測顯示TBC1D3可上調(diào)MMP-9蛋

15、白水平，明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示TBC1D3可增強(qiáng)MMP-9活性，提示TBC1D3促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移可能是通過上調(diào)MMP-9的蛋白和活性水平。復(fù)合轉(zhuǎn)染CaM時，TBC1D3上調(diào)的MMP-9的蛋白和活性水平以及誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移均被增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1.CaM增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞漿、細(xì)胞核TBC1D3蛋白的穩(wěn)定性。
　　2.Ca2+/CaM與TBC1D3的N端157位-171位氨基酸序列相互作用。
　　3.泛素化位點(diǎn)K166