人附睪蛋白4對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響和機(jī)制研究及檢測(cè)方法的建立.pdf

1、乳腺癌是臨床上女性惡性腫瘤發(fā)病率最高的疾病之一，可對(duì)女性的生命健康造成嚴(yán)重危害，甚至危及生命。隨著乳腺癌早期診斷策略和規(guī)范化多學(xué)科綜合治療技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌患者死亡率逐漸下降，但發(fā)病率卻逐年上升，在女性高發(fā)腫瘤中居首位。因此，對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制、臨床早期診斷及預(yù)后療效評(píng)價(jià)是目前國(guó)內(nèi)外該病亟待解決的難點(diǎn)和研究的熱點(diǎn)。
　　人附睪蛋白4（HE4）是一種富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，自1991年Kirchhoff等學(xué)者發(fā)現(xiàn)至今，已先后發(fā)

2、現(xiàn)其在卵巢癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中均存在高表達(dá)。大量研究證實(shí)HE4在相關(guān)腫瘤血清學(xué)診斷上具有較高的靈敏度和特異性，能夠較好地輔助臨床進(jìn)行診斷及預(yù)后判斷。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì) HE4臨床研究多集中于卵巢腫瘤血清學(xué)檢測(cè)方面，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，發(fā)現(xiàn)其與卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等生物學(xué)特性相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)HE4在乳腺癌組織中也存在高表達(dá)，其表達(dá)與乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)并可能是乳腺癌復(fù)發(fā)的一個(gè)預(yù)測(cè)因素，且CA153和HE4聯(lián)合

3、使用可明顯提高臨床乳腺癌診斷的敏感性和準(zhǔn)確性，但目前HE4在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制尚未明確。
　　乳腺癌的預(yù)防與治療需要早期診斷技術(shù)的發(fā)展與相關(guān)分子作用機(jī)制的闡明。HE4作為一個(gè)日漸成熟的腫瘤診斷標(biāo)志物，我國(guó)已經(jīng)在一定范圍內(nèi)開展了HE4檢測(cè)項(xiàng)目，其檢測(cè)方法主要為酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法，但缺乏床旁快速檢測(cè)及可在基層社區(qū)醫(yī)院廣泛應(yīng)用的技術(shù)方法，嚴(yán)重阻礙了HE4在臨床疾病篩查及診斷中的應(yīng)用。因此，急需研發(fā)價(jià)格低廉的新型快

4、速HE4診斷試劑。熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)是一種新型的快速定量檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、結(jié)果快速、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，其性能指標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它快速檢測(cè)技術(shù)，已逐漸成為診斷試劑研發(fā)的熱點(diǎn)。
　　為明確HE4在乳腺癌發(fā)展中的作用及相關(guān)機(jī)制，并為臨床診斷提供有效的技術(shù)支持，本課題從以下兩個(gè)方面對(duì)HE4進(jìn)行研究：1.觀察人乳腺癌組織和細(xì)胞株中HE4表達(dá)情況，構(gòu)建慢病毒干擾載體，研究HE4基因沉默對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響及相關(guān)機(jī)制，觀察其對(duì)裸

5、鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響，為從分子水平上治療乳腺癌提供一種新思路。2.采用基因工程及蛋白純化技術(shù)獲得HE4重組蛋白，并初步建立一種HE4熒光免疫層析檢測(cè)方法，為國(guó)內(nèi)HE4診斷試劑的研制提供一種新方法。
　　第一部分乳腺癌組織和細(xì)胞中HE4的表達(dá)差異及構(gòu)建HE4基因沉默乳腺癌細(xì)胞株
　　目的：
　　檢測(cè)乳腺癌組織和細(xì)胞中HE4 mRNA及蛋白表達(dá)變化，通過構(gòu)建慢病毒載體，獲得HE4低表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株，為下一步研究HE4在乳腺癌

6、細(xì)胞中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.收集浸潤(rùn)性乳腺癌組織及癌旁組織各30例，免疫組化檢測(cè) HE4蛋白的表達(dá)變化。
　　2．采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）和Western blot法檢測(cè)HE4在人正常乳腺細(xì)胞Hs578Bst及乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF7中的表達(dá)。
　　3．構(gòu)建HE4 RNAi慢病毒感染載體，感染MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株，分別用Real-tim

7、e PCR及Westernblot法檢測(cè)感染細(xì)胞中HE4基因及蛋白表達(dá)，獲得HE4低表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株。
　　結(jié)果：
　　1．免疫組化結(jié)果顯示：HE4在浸潤(rùn)性乳腺癌組織與癌旁組織中均有表達(dá)，與癌旁組織相比，HE4在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中表達(dá)顯著升高（P<0.05）。
　　2．Real-time PCR和Westernblot結(jié)果顯示：乳腺癌MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞中的HE4表達(dá)水平均高于正常人乳腺細(xì)胞 Hs578B

8、st（P<0.05），并且在MDA-MB-231中的表達(dá)水平高于MCF7。因此，后續(xù)研究采用MDA-MB-231細(xì)胞株。
　　3.成功構(gòu)建HE4 RNAi慢病毒感染載體，經(jīng)Real-time PCR和Westernblot法驗(yàn)證在MDA-MB-231細(xì)胞株中的感染率約75％。
　　結(jié)論：
　　HE4在浸潤(rùn)性乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)均顯著增加，提示其可能在乳腺癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用。成功構(gòu)建HE4基因沉默乳腺癌細(xì)胞株用于后續(xù)

9、試驗(yàn)研究。
　　第二部分 HE4對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　采用HE4基因沉默MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞及裸鼠模型，探討HE4對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1．采用MTT法檢測(cè)HE4基因沉默對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響。
　　2．采用細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HE4基因沉默對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響。

10、>　　3．采用TUNEL染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) HE4基因沉默對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響。
　　4．采用Western blot法檢測(cè)HE4基因沉默對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞ERK、p-ERK、p-c-Jun、c-Fos、p-Akt、Akt、cleaved caspase-3、caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響。
　　5．建立裸鼠移植瘤模型，觀察HE4基因沉默對(duì)乳腺癌MDA-MB-2

11、31細(xì)胞致瘤能力的影響。
　　6．采用HE染色觀察成瘤細(xì)胞的形態(tài)變化及免疫組化法觀察HE4、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1. MTT結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，HE4基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力顯著降低（P<0.05）。
　　2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，HE4基因沉默后細(xì)胞愈合能力顯著變?nèi)酰≒<0.05）；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，HE4基因沉默后細(xì)胞遷移數(shù)顯著下

12、降，遷移能力降低（P<0.05）。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)及 TUNEL染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，HE4基因沉默后細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加（P<0.05）。
　　4. Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，HE4基因沉默導(dǎo)致相關(guān)蛋白p-ERK、p-c-Jun、c-Fos、p-Akt、MMP-9和MMP-2表達(dá)量降低（P<0.05），cleaved caspase-3表達(dá)量升高（P<0.05）。
　　5.裸鼠移植瘤模型

13、結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，細(xì)胞移植后HE4基因沉默組體內(nèi)瘤體生長(zhǎng)緩慢，5天后瘤體積開始出現(xiàn)明顯差異（P<0.05）。
　　6.免疫組化結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，HE4基因沉默組 HE4、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　HE4基因可能通過ERK-Jun-Fos和Akt信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移產(chǎn)生影響；HE4基因沉默對(duì)裸鼠移植瘤模型中腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。
　

14、　第三部分 HE4熒光免疫層析檢測(cè)方法的建立及初步評(píng)價(jià)
　　目的：
　　采用基因工程技術(shù)制備HE4重組蛋白，用于室內(nèi)參考品的建立；初步建立HE4熒光免疫層析檢測(cè)方法。
　　方法：
　　1．構(gòu)建HE4原核表達(dá)重組菌BL21-pET32-HE4，并對(duì)HE4重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化及免疫原性檢測(cè)。
　　2．采用鎳離子交換層析法純化HE4重組蛋白并檢測(cè)其純度。
　　3．采用市售試劑盒對(duì)HE4重組蛋白進(jìn)行標(biāo)

15、定，制備出一套本實(shí)驗(yàn)室用參考品，并對(duì)制備的參考品穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　4.建立HE4熒光免疫層析檢測(cè)方法并初步進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。
　　通過對(duì)硝酸纖維素膜，EDC用量、標(biāo)記抗體用量、包被抗體用量及偶聯(lián)微球稀釋倍數(shù)的選擇優(yōu)化，確定HE4熒光免疫層析檢測(cè)方法相關(guān)工藝，并對(duì)檢測(cè)方法的線性范圍、精密性、穩(wěn)定性和回收率進(jìn)行評(píng)價(jià)。選取40份HE4臨床血清，進(jìn)行檢測(cè)方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其檢測(cè)效果。
　　結(jié)果：
　　1．獲得HE4蛋白

16、原核表達(dá)菌BL21-pET32-HE4，并確定蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：IPTG濃度0.2 mmol/L，溫度37℃，時(shí)間3 h，實(shí)現(xiàn)了HE4蛋白的可溶性表達(dá)。采用SDS-PAGE檢測(cè)純化后HE4重組蛋白純度達(dá)90%以上。
　　2．制備出一套線性參考品（15 pmol/L、150 pmol/L、300 pmol/L、750 pmol/L、1500 pmol/L），一套線性范圍參考品（5 pmol/L、10 pmol/L、15pmol/

17、L、50 pmol/L、150pmol/L、300pmol/L、750pmol/L、1000pmol/L、1200 pmol/L、1500pmol/L、1800 pmol/L、2000 pmol/L）及一份精密性參考品750 pmol/L。穩(wěn)定性結(jié)果顯示參考品在4℃保存7天及-80℃保存半年穩(wěn)定性良好。
　　3.確定HE4熒光免疫層析檢測(cè)方法相關(guān)工藝：硝酸纖維素膜：No.01；EDC加入量：1μL固含量為1.05%的熒光微球?qū)?yīng)的

18、EDC用量為8μg；標(biāo)記抗體量：1μL固含量為1.05%的熒光微球?qū)?yīng)的標(biāo)記抗體用量為5μg；T線包被抗體量：1.5 mg/mL；偶聯(lián)微球稀釋倍數(shù)：300倍。線性范圍：15-1500 pmol/L；批內(nèi)精密性：7.9%；批間精密性：9.8%；穩(wěn)定性：37℃穩(wěn)定保存7 d；高、中、低值參考品回收率分別為99.75%、99.8%、96%。
　　4.與羅氏檢測(cè)試劑同時(shí)檢測(cè)40份 HE4血清，結(jié)果表明兩者相關(guān)性較好，回歸方程：Y=0.92