作用于nAChRα3β2亞型特異α-芋螺毒素的設(shè)計(jì)合成及該靶點(diǎn)的功能研究.pdf

1、煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)廣泛分布于肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)與肌肉的信號(hào)傳導(dǎo)，與學(xué)習(xí)、感覺(jué)、煙堿成癮、神經(jīng)紊亂及帕金森癥密切相關(guān)，是目前最受關(guān)注得離子通道及膜蛋白之一。最新研究表明nAChR受體α3β2亞基與鎮(zhèn)痛等有關(guān)。
　　 本課題以作用于nAChR受體α3β2的α-芋螺毒素AnIB為模板，根據(jù)α-芋螺毒素對(duì)該受體亞型的選擇性要求，設(shè)計(jì)了一系列α型芋螺毒素突變體，利用一步及分布氧化法進(jìn)行了氧化折疊，純

2、化得到了8個(gè)多肽。為評(píng)價(jià)該系列衍生物的藥理學(xué)活性，應(yīng)用大鼠坐骨神經(jīng)半切模型，評(píng)價(jià)了多肽的鎮(zhèn)痛活性。合成了AnIB[A11G]熒光標(biāo)記物，并測(cè)定了nAChRα3β2亞型在小鼠腦內(nèi)分布。
　　 為了進(jìn)一步測(cè)定AnIB突變體對(duì)α3β2的活性及選擇性關(guān)系，我們構(gòu)建了雙電極電壓鉗研究α3β2的電生理平臺(tái)。我們從大鼠腦內(nèi)、肺部等組織克隆nAChR10個(gè)亞基，并構(gòu)建pcDNA3.1(+)和pcI表達(dá)載體。獲得主要結(jié)果如下：
　　 1.

3、合成了8個(gè)α型芋螺毒素突變體，其中3個(gè)采用一步氧化折疊方法合成，5個(gè)用兩步法合成，氨基酸突變后影響芋螺多肽的折疊效率。
　　 2.由AnIB及vc1.1組成的雜合肽(GCC SDPR CAGNNQDYC-NH2，Z-1)具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性，高于對(duì)照肽Vc1.1，其余研究的多肽活性接近或低于Vc1.1。
　　 3.5-TAMRA-AnIB[A11G]熒光標(biāo)記物主要分布于小鼠大腦海馬區(qū)，少量分布于紋狀體，在小腦及腦部其它區(qū)域

4、分布很少或沒(méi)有分布。而對(duì)照組5-TAMRA除皮層外非選擇性結(jié)合了腦內(nèi)區(qū)域。α3β2的在腦內(nèi)的分布與其鎮(zhèn)痛功能的發(fā)揮相對(duì)應(yīng)。
　　 4.克隆了大鼠nAChRα2、α3、α4、α6、α7、α9、α10、β2、β3、β4等十個(gè)亞基，克隆中克服nAChR亞基mRNA峰度低、GC含量高、同源性較高、片斷長(zhǎng)、保真性等問(wèn)題，并構(gòu)建pcDNA3.1(+)和pcI表達(dá)載體。將nAChR受體經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄為編碼nAChR受體并加帽的cRNA，顯微注射到