器官型腦片糖氧剝奪模型的建立及NBP對(duì)此模型細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：建立大腦皮層器官型腦片的氧糖剝奪模型(Oxygen andGlucose Deprivation，OGD)，并在此基礎(chǔ)上觀察正丁基苯酞(NBP)對(duì)細(xì)胞凋亡和線粒體電位的影響。
　　方法：選擇出生后5-7天(P5-7)的SD(Sprague Dawley)乳大鼠，制備大腦皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)的器官型腦片，采用膜插件的方法進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察其形態(tài)，并分別于1w，2w，3w，4w時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行SMI-32染色，觀察其中的錐體細(xì)胞發(fā)育并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2、2周后，隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)和實(shí)驗(yàn)組(T0，F(xiàn)0.01，T0.1，T1，T10組)，每組九片，更換含Propidium iodide(PI，1μg/ml)的培養(yǎng)液，孵育20min，倒置熒光顯微鏡下拍照(4X，曝光時(shí)間1.038ms，靈敏度ISO1600)后T組采用厭氧罐氧剝奪，更換無(wú)糖培養(yǎng)液(含PI)的方式，進(jìn)行OGD干預(yù)30min，后依次更換含不同劑量NBP(0，0.01，0.1，1，10μM)的正常糖含量培養(yǎng)液(含PI)，C組與T

3、組同一時(shí)間更換正常培養(yǎng)液。分別在干預(yù)前和恢復(fù)正常條件1小時(shí)后，觀察PI染色。并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇T0組和T10組，分別在不同時(shí)間點(diǎn)(OGD30min，NBP1h，24h，72h，7d)同樣條件下拍照。另外C組和T組，進(jìn)行OGD和NBP干預(yù)(培養(yǎng)液不添加PI)，于1h進(jìn)行JC-1線粒體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線粒體膜電位的變化。
　　結(jié)果：
　　1腦片在體外培養(yǎng)存活良好，無(wú)明顯的壞死區(qū)域，鏡下觀察可見(jiàn)腦片體積逐漸增大，變薄，透光度增加，

4、皮層和皮層下結(jié)構(gòu)分界清晰，1、2、3、4周的腦片，進(jìn)行SMI-32免疫組化染色，可見(jiàn)SMI-32陽(yáng)性的細(xì)胞排列整齊，每個(gè)細(xì)胞有一個(gè)長(zhǎng)的頂樹(shù)突伸向皮層，并維持穩(wěn)定的數(shù)目；
　　2 OGD前后PI染色熒光強(qiáng)度值有明顯變化，并在恢復(fù)正常糖氧供應(yīng)條件后，仍有持續(xù)增強(qiáng)，在72h和7d時(shí)的觀察值明顯的升高，各時(shí)間點(diǎn)之間及與正常對(duì)照組相比均存在明顯差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：
　　3器官型腦片OGD30min后，對(duì)照組(C組

5、)和實(shí)驗(yàn)組(T0，T0.01，T0.1，T1，T10組)，PI染色可見(jiàn)不同亮度的紅色熒光，與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組各亞組的熒光強(qiáng)度均大于對(duì)照組，各組紅色熒光強(qiáng)度依次增強(qiáng)，與NBP濃度(0-10μM范圍內(nèi))呈負(fù)相關(guān)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組各亞組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)：
　　4 T0組和T10組，分別觀察不同時(shí)間點(diǎn)(OGD30min，NBP+再灌注1h，24h，72h，7d)PI染色，可見(jiàn)兩組在OGD30min后均出

6、現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡，兩組無(wú)顯著性差異。T0組隨時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡明顯增加，在72h和7d時(shí)的觀察值明顯的升高。然而NBP組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，PI染色逐漸減少，各組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：
　　5對(duì)照組(C組)和實(shí)驗(yàn)組(T0，T0.01，T0.1，T1，T10組)(培養(yǎng)液不添加PI)，JC-1線粒體檢測(cè)試劑盒染色可見(jiàn)OGD30min，復(fù)氧復(fù)糖1h后，紅色熒光/綠色熒光(R/G)的值明顯減小，R/G的值與NBP濃度呈正

7、相關(guān)，實(shí)驗(yàn)組各亞組的R/G的值均小于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組各亞組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；
　　結(jié)論：
　　1 SD大鼠P5-7乳鼠可以作為體外腦片培養(yǎng)的供體；
　　2體外培養(yǎng)的大腦皮層器官型腦片具有與體內(nèi)類(lèi)似的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，錐體細(xì)胞分布，可以作為研究外界刺激對(duì)皮層神經(jīng)元影響的各種模型制作的平臺(tái)；
　　3 OGD模型操作方便，能夠誘導(dǎo)腦片損傷，出現(xiàn)細(xì)胞的急性死亡和遲發(fā)性凋亡，模擬了缺血性腦損傷