臨床應(yīng)用PRP制備方法的比較研究.pdf

1、目的:用對(duì)兔脂肪干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)增殖的影響來(lái)驗(yàn)證Tubex和傳統(tǒng)二次離心法制各自體富血小板血漿(platelet-richplasma，PRP)各自生物學(xué)效應(yīng)，來(lái)探討一種安全、快速、高效制備PRP的方法。
　　 方法:1.選用新西蘭大白兔，雄性，取兔附睪部區(qū)脂肪墊，Ⅰ型膠原酶消化法培養(yǎng)兔ADSCs，并觀察細(xì)胞形態(tài)特征。
　　 2.選取P4第4代ADSCs進(jìn)行成脂、成骨

2、誘導(dǎo)分化及染色來(lái)鑒定ADSCs。
　　 3.PRP的制備采用兔心臟穿刺抽血，二次離心的方法，并行血小板計(jì)數(shù)及血小板回收率的計(jì)算。
　　 4.將第4代細(xì)胞分為空白組（完全培養(yǎng)基180μl+單純DMEM培養(yǎng)基20μl）;對(duì)照組（細(xì)胞180ul+單純DMEM培養(yǎng)基20ul）、全血組(細(xì)胞180ul+全血血漿20ul)、Tubex制備的PRP組（細(xì)胞180ul+PRP20ul）、傳統(tǒng)二次離心法制備的PRP組（細(xì)胞180ul+PR

3、P20ul）。采用CCK-8法(Cell-CountingKit-8)檢測(cè)不同作用時(shí)間(24h、48h、72h)各組對(duì)ADSCs增殖活動(dòng)的影響。
　　 5.將全血、Tubex制備的PRP及傳統(tǒng)二次離心法制備的PRP采用雙抗夾心法(ELISA)檢測(cè)其中血小板源性生長(zhǎng)因子(plateletderivedgrowthfacto，PDGF-AB)的濃度。
　　 結(jié)果:1.原代細(xì)胞提取后鏡下觀其形狀為圓形、大小不等。培養(yǎng)24小時(shí)后

4、可見(jiàn)有少量的細(xì)胞貼壁形狀為不規(guī)則細(xì)長(zhǎng)型，可有像偽足一樣的突起。3天后鏡下觀大量細(xì)胞已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)，形狀為比較細(xì)的長(zhǎng)梭形，細(xì)胞開(kāi)始增大并可見(jiàn)核分裂相，梭形細(xì)胞逐漸增多。5天后細(xì)胞的密度明顯增加，呈現(xiàn)出團(tuán)簇狀、并向各個(gè)方向伸展形成集落，大小不一，多為長(zhǎng)梭形。細(xì)胞融合在80％-90％時(shí)即可胰酶?jìng)鞔?br>　　 2.成骨誘導(dǎo)三周茜素紅染色呈陽(yáng)性，成脂誘導(dǎo)兩周油紅O染色呈陽(yáng)性，
　　 3.全血血小板計(jì)數(shù)為（260.2±96.8）×109

5、/L;傳統(tǒng)二次離心法提取的PRP血小板計(jì)數(shù)為(1508.8±557.0)×109/L;Tubex提取的PRP血小板計(jì)數(shù)為(3140.0±291.5)×109/L。Tubex制備的PRP血小板計(jì)數(shù)是全血的12.06倍，是傳統(tǒng)二次離心法制備的PRP的2.08倍
　　 4.按血小板回收率計(jì)算公式計(jì)算Tubex制備的PRP和傳統(tǒng)二次離心法制備的PRP的回收率，結(jié)果:Tubex制備的PRP血小板回收率為82.86％，傳統(tǒng)方法回收率為72.

6、54％。
　　 5.CCK-8法顯示Tubex提取的PRP與傳統(tǒng)二次離心法提取的PRP對(duì)ADSCs有明顯的增殖作用。Tubex提取的PRP組在與傳統(tǒng)組比較，其差異有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 6.PRP中血小板源性生長(zhǎng)因子PDGF-AB的濃度采用ELISA法檢測(cè)，結(jié)果顯示:Tubex制備的PRP中PDGF-AB的濃度明顯高于傳統(tǒng)二次離心法制備的PRP及全血PDGF-AB的濃度，其差異均有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P