米曲霉尼古丁去甲基酶的篩選與克隆表達(dá)分析.pdf

1、尼古丁(Nicotine)是煙草植物中主要的生物堿，廣泛存在于煙草制品中。吸煙對(duì)人體有害，大量的人因?yàn)槲鼰煻劳?，?020年，預(yù)計(jì)每年會(huì)有超過(guò)900萬(wàn)的人因?yàn)槲鼰煻劳觥Ｄ峁哦∈且环N擬交感神經(jīng)藥，釋放兒茶酚胺，能增加心率和心肌收縮力，縮短皮膚和冠狀動(dòng)脈血管，短暫升高血壓，降低對(duì)胰島素的敏感性，可能加重糖尿病，并可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。由于煙草制品使用量的增加，煙草行業(yè)產(chǎn)生了含有高濃度尼古丁的固體和液體煙草廢料，尼古丁易溶解于水導(dǎo)致地下水

2、的污染，進(jìn)而會(huì)擾亂土壤的生態(tài)平衡。因此，為了防止尼古丁污染土壤和水，除去煙草廢料中的尼古丁相當(dāng)重要。
　　尼古丁在人體、植物和微生物的降解已經(jīng)有很多報(bào)道。在人體中，尼古丁被肝臟代謝成多種代謝物，其中的六種主要代謝產(chǎn)物為可替寧、1'-(R)-2'-(S)-順式尼古丁-N氧化物和1'-(S)-2'-(S)-反式尼古丁-N氧化物、N-甲基煙堿離子、尼古丁葡萄糖醛酸苷、2'-羥基煙堿以及去甲基尼古丁。尼古丁的去甲基化代謝是尼古丁在全身清除

3、中相對(duì)較小的途徑，目前報(bào)道與尼古丁去甲基有關(guān)的酶為CYP2A6、CYP2B6、CYP2D6等。尼古丁在煙草植物中也是由尼古丁去甲基酶催化生成去甲基尼古丁的，目前報(bào)道CYP82E4、CYP82E5v2和CYP82E10為尼古丁去甲基酶。CYP82E4一般存在于衰老的葉片，CYP82E5v2主要存在于新鮮的葉片，而CYP82E10主要在根部表達(dá)。微生物對(duì)尼古丁有很強(qiáng)的降解能力，開(kāi)發(fā)和利用尼古丁降解的微生物資源，對(duì)維持生態(tài)平衡有重大影響。因此

4、，越來(lái)越多的尼古丁代謝已經(jīng)得到了研究。在微生物中尼古丁降解主要有三種途徑:吡啶途徑、吡咯途徑以及去甲基化途徑。其中，節(jié)桿菌屬和假單胞菌屬分別是吡咯途徑和吡啶途徑的典型代表。去甲基化途徑在真菌中已經(jīng)報(bào)道，但是尼古丁代謝途徑的研究?jī)H為發(fā)現(xiàn)初始步驟為尼古丁的去甲基化。本實(shí)驗(yàn)室在國(guó)際上首次提出一條全新的米曲霉Aspergillus oryzae112822降解尼古丁的代謝途徑，填補(bǔ)了真菌尼古丁代謝途徑的空白，但是該代謝途徑涉及到的酶及其分子生物

5、學(xué)研究仍屬于空白。
　　目前，已經(jīng)確定生物體中尼古丁的去甲基化是由P450單加氧酶催化，細(xì)胞色素P450大多數(shù)屬于膜蛋白。膜蛋白的過(guò)表達(dá)問(wèn)題是其功能和結(jié)構(gòu)研究中的主要瓶頸，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種異源表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)膜蛋白。例如，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，它們對(duì)于膜蛋白的表達(dá)各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)是非常重要的。大腸桿菌是表達(dá)重組蛋白最常用的宿主系統(tǒng)，有研究

6、人員開(kāi)發(fā)了一些優(yōu)化P450在大腸桿菌中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)策略，例如N-端修飾、分子伴侶蛋白共表達(dá)、載體的選擇和密碼子優(yōu)化的基因合成等，這些策略對(duì)于P450的表達(dá)是值得借鑒的。
　　本文針對(duì)米曲霉A.oryzae112822降解尼古丁第一步反應(yīng)的尼古丁去甲基酶展開(kāi)研究，第一步反應(yīng)需要CYP和CPR的共同參與。本實(shí)驗(yàn)室的前期工作已經(jīng)通過(guò)酶的分離純化、肽譜分析和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析技術(shù)篩選了9個(gè)候選蛋白。成功克隆了CYP1、CYP2、CYP3、CYP

7、4、CYP5、CYP7、CYP8、CYP9和CYP10的基因，并且也同時(shí)克隆了米曲霉和釀酒酵母的NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)的基因。我們提取了米曲霉和釀酒酵母的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板成功地克隆出了相應(yīng)的CYP和CPR的基因。隨后，針對(duì)這9個(gè)CYP和2個(gè)CPR的異源表達(dá)和功能研究開(kāi)展工作，我們首先嘗試在大腸桿菌中表達(dá)CYP和CPR，其中，米曲霉CPR和釀酒酵母CPR成功獲得了可溶性表達(dá)并且具有電子

8、傳遞活性;CYP1、CYP2、CYP5、CYP8和CYP10也獲得了表達(dá)，但是除了CYP8外，其余都形成包涵體，無(wú)法檢測(cè)酶蛋白的活性。只有CYP8能夠與CO結(jié)合形成450nm的特征吸收峰，將CYP8分別與Ao.CPR和Se.CPR進(jìn)行尼古丁的降解活性實(shí)驗(yàn)，沒(méi)有檢測(cè)到尼古丁的減少與去甲基尼古丁的生成。據(jù)報(bào)道，CYP8是一種一氧化氮還原酶，在NAD(P)H的存在下，能直接將NO還原為N2O而不需要CPR的參與。為了驗(yàn)證CYP8的底物活性，設(shè)

9、計(jì)實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)NADH的特征吸收峰340nm的減少來(lái)判斷CYP8的催化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NADH存在的條件下，CYP8能降低340nm處的吸收峰，說(shuō)明CYP8具有催化NO的能力。
　　根據(jù)肽譜分析和轉(zhuǎn)錄組分析，CYP1的肽譜匹配率為10％，轉(zhuǎn)錄上調(diào)最高，推測(cè)CYP1最有可能是尼古丁去甲基酶。因此，為了增加CYP1在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，通過(guò)N-端跨膜域的截短和加入親水性的氨基酸序列修飾N-端等方法構(gòu)建了表達(dá)載體，對(duì)CYP1進(jìn)行了

10、5種N-端修飾，分別為1.Native(MA-);2.CYP1△(3-28);3.CYP1(17α);4.CYP1(2C3);5.CYP1(2E1)。使用了pCWori、pET21b、pET22b和pET28b等4種不同的表達(dá)載體，以及DH5α、BL21、RosettagamiB和JM109等4種不同的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行CYP1的表達(dá)，以探索CYP1的最佳N-端修飾序列以及最佳的表達(dá)載體與表達(dá)宿主的組合。成功地克隆出5種N-端修飾的C

11、YP1，并且成功地構(gòu)建相應(yīng)的4種表達(dá)載體。最后，篩選出了56株表達(dá)菌株，但是其中只有15株菌株能表達(dá)目的蛋白，并且都以包涵體形式表達(dá)。本文成功的克隆了米曲霉的9個(gè)CYP與米曲霉和釀酒酵母CPR，驗(yàn)證了CYP8的底物催化活性以及探索了CYP1的N-端序列修飾的表達(dá)。最后，我們將人體與植物中已知存在的尼古丁去甲基酶的氨基酸序列的在米曲霉基因組中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)CYP620亞家族具有較高的氨基酸序列相似性。結(jié)合肽譜分析與轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)CYP620