甘氨酸螯合鋅對(duì)大鼠腸道鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響及其吸收機(jī)理的初步探討.pdf

1、甘氨酸螯合鋅是第三代鋅源添加劑，具有生物效價(jià)高，吸收率高，化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點(diǎn)。鋅作為動(dòng)物必須的微量元素，通過(guò)催化或結(jié)構(gòu)作用參與機(jī)體多種酶和蛋白質(zhì)功能。甘氨酸螯合鋅相對(duì)于無(wú)機(jī)鋅來(lái)說(shuō)，具有穩(wěn)定性好，吸收率高，生物利用率高等優(yōu)點(diǎn)。但其具體的吸收機(jī)制尚無(wú)定論，本試驗(yàn)通過(guò)研究甘氨酸螯合鋅和硫酸鋅對(duì)大鼠腸道鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ZnT1，MT1，Zip4，Zip5轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的影響，初步比較兩種鋅源吸收的差異，并研究?jī)煞N鋅源對(duì)小肽吸收蛋白PepT

2、1基因水平和蛋白水平的影響來(lái)探討甘氨酸螯合鋅的可能吸收途徑;同時(shí)通過(guò)在日糧中添加不同劑量的甘氨酸螯合鋅，探索其對(duì)大鼠腸道鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)影響最顯著的劑量，為鋅吸收的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 （一）建立SD大鼠體外灌胃模型，24只21日齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，隨機(jī)分為3組，分別灌服生理鹽水，硫酸鋅，甘氨酸鋅。2h，6h后乙醚麻醉進(jìn)行屠宰，取血液，肝臟和腸道組織進(jìn)行相關(guān)試

3、驗(yàn)研究，通過(guò)對(duì)血清和肝臟鋅水平和鋅代謝相關(guān)酶活性的測(cè)定，比較兩種鋅源的生物學(xué)效價(jià)，同時(shí)采用Realtime-PCR方法研究不同鋅源對(duì)SD大鼠十二指腸，空腸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZnT1，Zip4，Zip5，MT1，PepT1mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，利用蛋白免疫印跡（Western-blotting）方法研究不同鋅源對(duì)ZnT1，Zip4，Zip5，MT1，PepT1蛋白表達(dá)的影響，研究結(jié)果顯示:
　　 (1)生理生化指標(biāo)表明:與對(duì)照組相比，

4、大鼠灌胃2h，6h后，Zinc-gly可明顯提高血清中鋅水平(P＜0.05)，Zinc-gly組血清鋅水平高于ZnSO4組，但差異不顯著，表明Zinc-gly具有較好的吸收效率。肝臟鋅水平表明，與對(duì)照組相比，兩種鋅源均可提高肝臟鋅水平，但差異不顯著。與對(duì)照組相比，灌胃Zinc-gly2h后，大鼠肝臟堿性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，同時(shí)高于ZnSO4組，但差異不顯著。6h后，Zinc-gly組的肝臟堿性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照

5、組和ZnSO4組(P＜0.05)，這表明甘氨酸螯合鋅在提高血清，肝臟堿性磷酸酶活性上效果要顯著優(yōu)于ZnSO4。與對(duì)照組和ZnSO4組相比，Zinc-gly可顯著提高肝臟Cu-ZnSOD酶活性(P＜0.05)。對(duì)于改善血清Cu-ZnSOD酶活性上，兩種鋅源沒(méi)有明顯差異，且與對(duì)照組相比，差異均不顯著。
　　 (2)基因水平分析表明:SD大鼠灌胃Zinc-gly后，十二指腸、空腸PepT1mRNA表達(dá)量均高于ZnSO4，同時(shí)也高于空白

6、對(duì)照組(P＜0.05)，但ZnSO4組和空白對(duì)照組相比十二指腸，空腸PepT1mRNA水平?jīng)]有明顯的差異。相對(duì)于ZnSO4組和空白對(duì)照組，大鼠灌服Zinc-gly可顯著提高空腸MT1mRNA水平(P＜0.05)，ZnSO4和空白對(duì)照相比MT1mRNA水平也有顯著的提升（P＜0.05），但在十二指腸中Zinc-gly組和ZnSO4組MT1mRNA水平差異不顯著。相對(duì)于Zinc-gly組和空白對(duì)照組，大鼠灌服ZnSO4可顯著提高十二指腸，空

7、腸ZnT1mRNA水平(P＜0.05)，與空白對(duì)照相比，Zinc-gly也可顯著提高十二指腸ZnT1mRNA水平(P＜0.05)。十二指腸中，相對(duì)于ZnSO4組和空白對(duì)照組，灌服Zinc-gly可顯著提高Zip4mRNA水平，ZnSO4組和空白對(duì)照組之間差異不顯著?？漳c中，ZnSO4組的Zip4mRNA表達(dá)量最高，顯著高于空白對(duì)照組，但與Zinc-gly組間差異不顯著。十二指腸中Zinc-gly組Zip5mRNA水平顯著高于ZnSO4組

8、和空白對(duì)照組，ZnSO4組Zip5mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，空腸中Zip5mRNA水平顯著降低，且Zinc-gly組和ZnSO4組Zip5mRNA水平均低于空白對(duì)照組。
　　 (3)蛋白水平分析表明:三個(gè)腸段（十二指腸，空腸，回腸）均以Zinc-gly組PepT1表達(dá)量最高，其表達(dá)量分別為78.1±3.0，42.8±2.1，57.3±2.5;十二指腸中ZnSO4組PepT1表達(dá)量高于空白對(duì)照組;空腸和回腸中，Z

9、nSO4組和空白對(duì)照組間PepT1表達(dá)量基本相同。MT1以ZnSO4組的表達(dá)量最高，三個(gè)腸段的表達(dá)量分別為:44.1±1.2，38.4±1.2，82.4±1.9;其次為Zinc-gly組，表達(dá)量分別為28.7±1.1，22.6±0.9，30.4±1.0;表達(dá)量最低的為空白對(duì)照組:表達(dá)量分別為:14.8±0.9，19.4±0.7，10.3±0.8。ZnT1的表達(dá)量以ZnSO4組的表達(dá)量最高，表達(dá)量分別為:64.3±1.8，50.5±3.0

10、，95.8±3.3;其次為Zinc-gly組，表達(dá)量分別為42.1±2.0，40.6±2.5，48.6±2.5，各個(gè)腸段中空白對(duì)照組ZnT1的表達(dá)量最低。Zip4蛋白的表達(dá)量以空白對(duì)照組最高，其表達(dá)量分別為:74.4±3.3，76.8±3.9，69.0±3.2，其次為甘氨酸鋅組，表達(dá)量分別為59.1±2.5，58.6±2.0，55.6±2.1。表達(dá)量最低的為硫酸鋅組，分別為31.3±1.8，33.5±2.5，48.8±1.8。Zip5蛋

11、白的表達(dá)量以ZnSO4組表達(dá)量最高，分別為58.4±2.0，66.5±2.2，57.8±2.1。其次為Zinc-gly組，表達(dá)量分別為:39.2±1.8，35.0±2.6，32.0±2.0。各腸段Zip5蛋白空白組表達(dá)量最低，表達(dá)量分別為:24.5±1.5，22.8±1.6，26.4±2.9。
　　 （二）30只21日齡SD大鼠（公母各半）隨機(jī)分為5組，每組6只，飼喂不同劑量的甘氨酸螯合鋅純合日糧，甘氨酸螯合鋅添加量分別為23.

12、81，142.86，285.71，571.43，857.14 mg/kg(折算成鋅元素分別為5.00;30.00;60.00;120.00;180.00mg/kg)，預(yù)飼兩天，正飼一周后屠宰取血清，肝臟和腸道組織，通過(guò)測(cè)定血清和肝臟鋅水平以及鋅代謝相關(guān)酶活性，并采用Realtime-PCR測(cè)定ZnT1，Zip4，Zip5，MT1，PepT1mRNA水平，得出甘氨酸螯合鋅調(diào)控上述基因表達(dá)的最佳劑量，研究結(jié)果表明:
　　 (1)隨著

13、日糧鋅水平的不斷提高，SD大鼠血清和肝臟中鋅水平也不斷提高，呈劑量遞增關(guān)系，第5組和第4組間差異顯著，第4組和1，2，3組間差異顯著(P＜0.05)，1，2，3組之間差異不顯著。肝臟鋅水平也隨日糧鋅水平增加而增加，1，2，3組之間差異不顯著，其余各組之間均差異顯著(P＜0.05)。血清Cu-ZnSOD酶活性以中間劑量組活性最高，其活性為345.71±18.14 U/mgpro，同時(shí)與其他各組之間差異顯著(P＜0.05)，肝臟Cu-ZnS

14、OD酶活性以最高劑量組（第五組）活性最高。血清堿性磷酸酶活性以中間劑量組活性最高，與1、2組之間差異顯著(P＜0.05)，與4、5組之間差異不顯著。肝臟堿性磷酸酶活性以中間劑量組活性最高，與1、2組之間差異顯著(P＜0.05)，與4、5組之間差異不顯著。
　　 (2)十二指腸，空腸PepT1 mRNA在中間劑量組處表達(dá)量最高，顯著高于其他劑量組，十二指腸、空腸MT1mRNA水平隨日糧鋅水平增加而增加。十二指腸中ZnT1mRNA表

15、達(dá)量除第2組外，其余各組隨甘氨酸螯合鋅添加量的增加而遞增，第5組ZnT1mRNA表達(dá)量最高，第5組與1、2、3、4組間差異均顯著(P＜0.05)?？漳c中各劑量組之間ZnT1mRNA表達(dá)量差異不顯著。十二指腸中Zip4mRNA水平隨甘氨酸螯合鋅添加量的增加而遞減，第1組（5mg/kg）Zip4mRNA水平表達(dá)量最高，其次為第3組，第2組，第4組，第5組，第1組與其余四組之間差異均顯著(P＜0.05)，2、3組;4、5組之間差異不顯著?？漳c

16、中Zip4mRNA水平也基本呈劑量依賴關(guān)系，隨甘氨酸螯合鋅劑量增加Zip4mRNA水平遞減。1、2、3組之間差異不顯著，與4，5組之間差異顯著(P＜0.05)。十二指腸中間劑量組Zip5mRNA表達(dá)量最高，但各組之間差異不顯著，空腸中亦是中間劑量組Zip5mRNA表達(dá)量最高，1、2、4、5組之間Zip5mRNA水平差異不顯著。
　　 上述結(jié)果提示:
　　 (1) SD大鼠灌胃試驗(yàn)表明，Zinc-gly在提高血鋅水平，改善

17、血清堿性磷酸酶活性，提高Cu-ZnSOD酶活性上效果要優(yōu)于ZnSO4;基因水平顯示，Zinc-gly能更好地刺激PepT1 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，可顯著提高空腸MT1 mRNA水平;相對(duì)于Zinc-gly，ZnSO4可顯著提高十二指腸，空腸ZnT1mRNA水平(P＜0.05)和蛋白水平。十二指腸中，相對(duì)于ZnSO4組和空白對(duì)照組，灌服Zinc-gly可顯著提高Zip4mRNA水平，Zip4蛋白的表達(dá)量以空白對(duì)照組最高，其次為Zinc-

18、gly組和ZnSO4組。十二指腸中Zmc-gly組Zip5mRNA水平顯著高于ZnSO4組和空白對(duì)照組。
　　 (2) SD大鼠血清和肝臟中鋅水平隨著日糧鋅提高而不斷提高，血清Cu-ZnSOD酶活性以中間劑量組活性最高，同時(shí)與其他各組之間差異顯著(P＜0.05)，肝臟Cu-ZnSOD酶活性以最高劑量組活性最高;血清和肝臟AKP酶活性以中間劑量組活性最高。十二指腸，空腸PepT1 mRNA在中間劑量組表達(dá)量最高;十二指腸中ZnT1