二球懸鈴木子葉再生體系的建立及ANT和BEL1同源基因的功能研究.pdf

1、二球懸鈴木(Platanus acerifolia)屬于基礎(chǔ)真雙子葉植物群，山龍眼目懸鈴木科木本植物，憑借其樹姿優(yōu)美、冠大遮陰、耐修剪易移栽等優(yōu)良特性，被廣泛種植于道路兩旁、公園等場所，在園林綠化中占有重要地位。但落花落果引起的花粉、果毛過敏問題日益嚴(yán)重，應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)研究其開花結(jié)果特性顯得日益緊迫，而打破二球懸鈴木難轉(zhuǎn)化的瓶頸已成為我們懸鈴木育種工作的重中之重。本研究嘗試以子葉為外植體，建立二球懸鈴木的再生體系;并優(yōu)化影響農(nóng)桿菌遺

2、傳轉(zhuǎn)化效率的因素，試圖建立其完善的轉(zhuǎn)化體系。同時(shí)通過對二球懸鈴木調(diào)控胚珠發(fā)育及種子形成的關(guān)鍵基因-ANT（AINTEGUMENTA）和BEL1(BELL1)同源基因及其啟動(dòng)子進(jìn)行克隆分析，研究其生物學(xué)功能，以為解決懸鈴木落毛問題提供幫助。主要研究結(jié)果如下:
　　1.以二球懸鈴木子葉為外植體，通過調(diào)整再生培養(yǎng)基的激素種類及濃度、外植體苗齡和壯芽培養(yǎng)基中BA和NAA的激素濃度，建立了二球懸鈴木穩(wěn)定的再生體系。結(jié)果表明，取萌發(fā)培養(yǎng)5d的

3、種子子葉為外植體，正面向上放置于再生培養(yǎng)基上，即MS+4.0mg·L-1BA+0.2mg·L-1NAA，光下培養(yǎng)40d左右，其不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)67.6±4.9％;將不定芽轉(zhuǎn)至壯芽培養(yǎng)基上，即MS+0.5mg·L-1BA+0.05mg·L-1NAA，光下培養(yǎng)25d左右，其不定芽可伸長至2-3cm，且成芽數(shù)為5.81±0.36個(gè)/每子葉;之后切取小芽轉(zhuǎn)至1/2-MS+0.1mg·L-1IBA生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根率可達(dá)89.3％以上

4、。
　　2.以二球懸鈴木子葉再生體系為依托，通過分析不同因素對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率的影響，發(fā)現(xiàn)其較有的轉(zhuǎn)化條件是:再生培養(yǎng)過程中Km篩選濃度為30mg·L-1，生根培養(yǎng)Km濃度為20mg·L-1，抑菌劑為400mg·L-1的Cef，侵染時(shí)間為15min，其GUS瞬時(shí)表達(dá)率為42.1％，抗性不定芽誘導(dǎo)率為8.75％;1.0mg·L-1BA和0.05mg·L-1NAA處理萌發(fā)階段的種胚可顯著性提高農(nóng)桿菌侵染后的子葉再生率，AGL1菌株

5、對子葉外植體再生的抑制作用也顯著性低于EHA105菌株，但該因素對提高子葉轉(zhuǎn)化效率還有待進(jìn)一步研究，且農(nóng)桿菌抑制外植體再生及轉(zhuǎn)化嵌合體可能是導(dǎo)致二球懸鈴木子葉穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化失敗的主要因素。
　　3.從二球懸鈴木中克隆得到3個(gè)ANT同源基因，分別命名為PaANT-1/2/3。通過實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，PaANTs基因在懸鈴木中表達(dá)模式基本一致，主要在發(fā)育中的雌花及柄下芽中表達(dá)，除PaANT-2外，其他兩個(gè)基因在種子發(fā)育過程中也有表達(dá);

6、這與PaANT-1啟動(dòng)子在煙草中的表達(dá)模式相一致，表明PaANT-1可能調(diào)控胚珠及種子的生長發(fā)育。
　　4.35S∷PaANTs轉(zhuǎn)化煙草可以促進(jìn)煙草葉片不定芽再生，且PaANT2/3可誘導(dǎo)胚狀體細(xì)胞的發(fā)生。此外PaANTs可促進(jìn)煙花萼片器官生長、種子增大，但花筒及雌雄蕊器官縮短，株型矮小、葉片褶皺，表明PaANTs在煙草中調(diào)控各組織的生長發(fā)育。PaANTs還通過調(diào)控類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)，影響煙草花瓣顏色。
　　5.從二球

7、懸鈴木中克隆得到2個(gè)BEL1同源基因，分別命名為PaBEL1-1/2;其在懸鈴木各組織器官中的時(shí)空表達(dá)模式基本一致，主要在根葉營養(yǎng)器官及發(fā)育中的種子、成熟期的雌雄花等生殖器官中表達(dá)。同時(shí)我們還分析了PaBEL1-1基因的啟動(dòng)子功能，發(fā)現(xiàn)pBI序列可誘導(dǎo)GUS在擬南芥胚珠形成至受精發(fā)育成魚雷形胚的整個(gè)過程中表達(dá)，其根葉等營養(yǎng)器官也可檢測到GUS表達(dá)，表明PaBEL1-1基因可能參與調(diào)控胚珠及種子的形態(tài)建成、營養(yǎng)器官發(fā)育等過程，但35S∷P