Polvhedrin融合家蠶溶菌酶BmLZM的表達(dá)、純化與活性檢測(cè).pdf

1、溶菌酶(lysozyme,LZM)(E.C.3.2.1.17)是由英國(guó)人Fleming在1922年首次在人的鼻黏液中發(fā)現(xiàn)。直到1937年Abraham和Robinson從卵蛋白中最先分離出溶菌酶晶體,人類開始了溶菌酶的研究。溶菌酶全稱1,4-β-N溶菌酶,又稱黏肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能夠切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸間的β-1,4糖苷鍵間的聯(lián)結(jié),破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)支架,在內(nèi)部滲透壓作用下,細(xì)胞脹裂開引起菌體裂解。溶菌酶作

2、為一種廣泛分布于自然界的天然蛋白質(zhì),有著藥理、保健、防腐等功能,應(yīng)用前景十分廣泛。此外溶菌酶還起著清除由其他抗菌蛋白作用細(xì)菌后產(chǎn)生的細(xì)胞碎片的作用,在免疫防御體系中也起著十分重要的作用。
　　 我們從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶cDNA文庫(kù)中檢索到一條序列,經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其蛋白序列與人溶菌酶有38％的同源性,通過(guò)PCR的方法從家蠶脂肪體組織cDNA中擴(kuò)增得到家蠶溶菌酶基因的ORF序列,并將其命名為BmLZM(Bombyxmori l

3、ysozyme),GenBank登錄號(hào)為L(zhǎng)37416.1。去除信號(hào)肽后該基因序列長(zhǎng)為360bp,編碼119個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為13.75 kD。我們將擴(kuò)增到的BmLZM基因融合多角體(Polyhedrin,Polh)基因后克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上,在Polh與BmLZM基因間引入一個(gè)編碼凝血酶(Thrombin,Thb)酶切位點(diǎn)的核酸序列,經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切鑒定和測(cè)序證明了重組子是正確無(wú)誤的。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入

4、大腸桿菌BL21(DE3),用終濃度為1 mM的IPTG誘導(dǎo)工程菌后,裂解菌體做SDS-PAGE分析,在45 kD附近的位置有一條特異性蛋白條帶,和預(yù)期值(His-Tag3.56 kD,Polh29 kD,BmLZM13.75 kD)相符。融合蛋白以包涵體形式存在,故用超聲裂解菌體后6,000 rpm離心所得的沉淀以調(diào)pH和離心方法純化融合蛋白His-Tag-Polh-BmLZM。以野生桿狀病毒Polh蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔,制備了

5、Polh的多克隆抗體。經(jīng)純化后的融合蛋白,用多角體蛋白的多克隆抗體進(jìn)行Western Blotting檢測(cè),確定重組融合蛋白已經(jīng)成功表達(dá)。將純化后的目的融合蛋白經(jīng)凝血酶酶切和離心后超濾,得到家蠶溶菌酶蛋白BmLZM。大腸桿菌熱激法BmLZM活性檢測(cè)顯示菌懸液明顯分為兩層,這是大腸桿菌細(xì)胞壁被溶解后細(xì)胞內(nèi)含物釋放所致,表明得到了有活性的BmLZM。瓊脂平板擴(kuò)散法檢測(cè)BmLZM蛋白抗菌活性,顯示溶壁微球菌的抑菌圈清晰可見。溶壁微球菌比濁法活