miR-101靶向調(diào)節(jié)AMPK表達抑制高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞自噬及促進其增殖.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是全球范圍終末期腎臟病(End stagerenal disease，ESRD)的最主要死亡原因之一，其患病率日益增加。
　　腎小球系膜細胞(Glomerular mesangial cells，GMCs)是腎臟重要的固有細胞之一，具有維持腎小球系膜區(qū)細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)代謝平衡的重要作用。
　　自噬是真核生物中進化保守的對

2、細胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)的重要過程，對維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用。DN時，氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活、缺氧等腎臟損傷因素在損傷腎臟的同時誘導細胞自噬，進而維持細胞穩(wěn)態(tài)與存活，而高糖條件下可導致GMCs自噬功能受到抑制，從而加重了損傷因素對腎臟系膜細胞的損傷。然而，在糖尿病(DiabetesMellitus，DM)狀態(tài)下的腎臟組織中，誘導細胞自噬的損傷因素增多，具有細胞保護作用的自噬現(xiàn)象不但沒有代償性

3、增高，反而處于抑制狀態(tài)，這種損傷作用增強、保護作用減弱的矛盾提示，DM狀態(tài)下GMCs的自噬功能缺陷可能參與了DN的發(fā)生與發(fā)展，為我們探究DN的發(fā)病機制提供了新思路。
　　MicroRNAs是一種內(nèi)源性非編碼單鏈核苷酸，其長度約為19-25個核苷酸。microRNAs調(diào)節(jié)了細胞生長，組織分化，參與多種細胞學行為，因而與生命過程中發(fā)育、疾病密切相關?，F(xiàn)已證實microRNA的種子序列能通過完全或幾乎完全堿基互補配對的方式與靶基因mRN

4、A3'端非編碼區(qū)相結合從而引導沉默復合體降解mRNA或阻礙其翻譯，進而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達。miR-101是眾多microRNAs中的一員，近年來多有文獻報道m(xù)iR-101能夠通過抑制腫瘤細胞的自噬反應，增加腫瘤細胞對放化療藥物的敏感性，也有報道其表達量下降能在體內(nèi)或體外抑制腫瘤的生長。Chigusa Higuchi等發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者(Type2 diabetes，T2D)血清中l(wèi)og10miR-101的濃度比正常糖耐量患者(

5、Normal glucosetolerance，NGT)明顯增高。miR-101在動物體內(nèi)多種組織中的表達譜顯示，它在胰腺組織中高表達，而T2D組血清中高表達的miR-101除了來源于胰腺組織還是可能來源于其他組織？目前還不清楚。在腫瘤細胞中，miR-101能通過負性調(diào)控靶基因（如E2H2、STMN1、RAB5A、ATG4D等）的表達抑制腫瘤細胞的自噬反應，增強其凋亡。在DN中，高糖可以抑制GMCs的自噬反應，而miR-101在T2D患

6、者血清中的表達量升高，且它能夠靶向調(diào)控自噬基因，那么miR-101在DN的GMCs中是否表達增高，能否抑制GMCs的自噬反應，從而影響DN的發(fā)生發(fā)展。
　　腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是真核生物中高度保守的能量感受器，廣泛表達于所有類型的腎臟細胞，其磷酸化活性降低與DN的發(fā)生發(fā)展關系密切，當AMP/ATP比率升高時被激活，被認為是糖尿病治療的有效新靶點之一。有報道證明:白

7、藜蘆醇可以通過對AMPK的激活減輕DN早期的腎臟損害。AMPK對自噬作用的調(diào)節(jié)也起到關鍵作用，在DN中，AMPK的活性受到抑制，GMCs的自噬功能減弱，而激活AMPK信號通路可以改善高糖誘導的GMCs自噬功能障礙。因此，高糖刺激下GMCs的AMPK磷酸化活性降低與自噬抑制有關，而激活AMPK可改善高糖刺激下系膜細胞的自噬功能。
　　本課題以小鼠腎小球系膜細胞株SV40 Mes作為研究對象，首先通過體外培養(yǎng)SV40 Mes細胞觀察高

8、糖對SV40 Mes細胞自噬、增殖能力及miR-101表達水平的影響，然后行雙熒光素酶檢測驗證AMPK是否為miR-101的直接靶基因，利用qRT-PCR、Western blot法分別檢測轉(zhuǎn)染miR-101對SV40 Mes細胞AMPK mRNA及蛋白水平的影響。最后研究高糖條件下miR-101對SV40 Mes細胞自噬、增殖能力的影響，旨在為DN的治療提供理論依據(jù)并尋找新思路。
　　本課題由以下兩個部分的研究組成:
　　

9、第一部分 高糖條件下小鼠腎小球系膜細胞自噬、增殖及miR-101表達量的關系，驗證小鼠系膜細胞存在miR-101對AMPK的直接調(diào)控關系
　　目的：
　　1.觀察高糖對小鼠系膜細胞株SV40 Mes自噬、增殖能力及miR-101表達量的影響以及三者之間的關系;
　　2.驗證SV40 Mes細胞中存在miR-101對AMPK的直接調(diào)控關系。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng):采用含10％胎牛血清的1640低糖培養(yǎng)

10、基，于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細胞株SV40 Mes。
　　2.用高糖(30mM)分別干預SV40 Mes0、24、48、72h，同時設對照組甘露醇組(30mM)。分組:正常糖組NG、甘露醇組Man、高糖組HG以及高糖干預時間梯度組:HG0h、HG24h、HG48h、HG72h共7組。檢測指標:a、用WB測各組細胞胞質(zhì)型微管相關蛋白1輕鏈3(Cytosolic truncated form of LC3，

11、LC3BⅠ)、自噬體膜型微管相關蛋白1輕鏈3(Autophagosomal membraneassociated form of LC3，LC3BⅡ)、AMPK、p-AMPK、PCNA的表達水平;b、用CCK8試劑盒檢測各組細胞的增殖率;c、用qRT-PCR測各組細胞miR-101的表達水平。
　　結果：
　　1.高糖環(huán)境下SV40 Mes細胞自噬體形成標志蛋白LC3B的自噬水平隨著刺激時間延長逐漸降低;HG72h SV40

12、 Mes細胞LC3B蛋白的自噬水平最低。干預72h后，HG組SV40 Mes細胞LC3B蛋白的自噬水平較NG組顯著降低(P＜0.05);NG組與Man組SV40 Mes細胞LC3B蛋白的自噬水平未見明顯異常(P＞0.05)。
　　2.高糖刺激72小時(HG72h)后，SV40 Mes細胞內(nèi)PCNA蛋白的含量較HG0h顯著增多(P＜0.05);高糖刺激其他時間點SV40 Mes細胞內(nèi)PCNA蛋白的含量無明顯差異。干預72h后，HG組

13、SV40 Mes細胞內(nèi)PCNA的含量較正常組顯著增高(P＜0.05); NG組與Man組SV40 Mes細胞內(nèi)PCNA的含量未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結論：
　　1.高糖抑制SV40 Mes細胞自噬相關蛋白的表達，其作用與滲透壓無關;可見，在DM狀態(tài)的腎臟中，葡萄糖毒性損傷了GMCs的自噬功能。
　　2.高糖誘導SV40 Mes細胞內(nèi)PCNA蛋白表達量增加，其作用與滲透壓無關;高糖促進SV40 Mes細胞的

14、增殖。
　　3.高糖使SV40 Mes細胞內(nèi)miR-101的表達量增加，其作用與滲透壓無關。
　　4.在高糖誘導SV40 Mes細胞內(nèi)miR-101表達量增加中，自噬減弱、增殖能力增強與miR-101增加有關。
　　5.高糖誘導SV40 Mes細胞內(nèi)AMPK的蛋白表達水平與miR-101的表達量呈負相關。
　　6.miR-101的種子序列能與AMPK-3'UTR直接結合并降低AMPK mRNA及蛋白的表達水平。<

15、br>　　7.miR-101可能通過調(diào)控AMPK的表達抑制SV40 Mes細胞自噬、促進其增殖。
　　第二部分 驗證miR-101調(diào)控SV40 Mes細胞的自噬、增殖能力
　　目的：
　　證明miR-101能調(diào)控高糖條件下SV40 Mes細胞的自噬、增殖能力。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng):同第一部分。
　　2.miR-101抑制高糖環(huán)境下SV40 Mes細胞的自噬反應。分組:NG、HG、miR-10

16、1-mimic+HG、 mimic-control+HG、 miR-101-inhibitor+HG、inhibitor-control+HG共6組。檢測指標:a、用透射電子顯微鏡觀察各組細胞的自噬體形態(tài)并計數(shù);b、用WB測各組細胞LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白的表達水平。
　　結果：
　　1.加入高糖后顯示:miR-101-mimic組SV40 Mes細胞的自噬體形成標志蛋白LC3B自噬水平較高糖組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(

17、P＜0.05);而miR-101-inhibitor組LC3B蛋白自噬水平比高糖組高，差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.在透射電子顯微鏡下，加入高糖后miR-101-mimic轉(zhuǎn)染組SV40 Mes細胞內(nèi)自噬體（以包含未消化細胞質(zhì)內(nèi)容物的特殊雙膜結構為特征）個數(shù)明顯減少，具有統(tǒng)計學意義;miR-101-inhibitor轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)自噬體個數(shù)最多。
　　3.SV40 Mes細胞在高糖條件下，miR-101-mimic組的PCNA蛋

18、白含量較高糖組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而miR-101-inhibitor組PCNA蛋白含量比高糖組低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.用CCK8法檢測高糖條件下SV40 Mes細胞增殖水平，加入高糖后，miR-101-mimic轉(zhuǎn)染組細胞增殖水平比高糖組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而miR-101-inhibitor轉(zhuǎn)染組細胞的增殖水平最低。
　　結論：
　　miR-1