不同亞型過氧化酶體增殖物激活受體對(duì)胎盤11β-HSD2和H2S合成酶表達(dá)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid, GC）在妊娠期間起著極其重要的作用，不僅調(diào)節(jié)各種胎盤激素的合成和釋放，還促進(jìn)胎兒器官特別是肺、腸道和腦等的成熟[1-3]。但是胎兒過早、過多的接觸GC可導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth restriction,IUGR），與妊娠期高血壓（pregnancy-induced hypertension, PIH）的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)[4,5]。妊娠期間母體血液中GC濃度

2、隨孕期不斷升高，是胎兒循環(huán)的5到十倍，且GC是甾體激素，可自由通過細(xì)胞膜，那么是如何保證在妊娠期間胎兒發(fā)育所需的一個(gè)適宜的GC環(huán)境呢？大量研究證實(shí)妊娠期間胎盤高表達(dá)的GC代謝酶——11β-羥基類固醇脫氫酶2（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2，11β-HSD2）在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，通過將有活性的GC代謝為無活性的代謝產(chǎn)物，以保證胎兒發(fā)育所需的適宜的GC環(huán)境，由此在胎盤局部起到功能性屏障作用[

3、6,7]。若胎盤11β-HSD2表達(dá)或功能異常，均可導(dǎo)致母體循環(huán)中高濃度GC通過胎盤進(jìn)入胎兒循環(huán)，使胎兒過早、過多地接觸GC，從而影響胎兒發(fā)育[8]。目前研究證實(shí)孕激素、NO、缺氧等可影響胎盤11β-HSD2的表達(dá)和活性[9]，但關(guān)于胎盤11β-HSD2表達(dá)和活性的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。
　　 過氧化物酶體增殖體激活受體（peroxisome proliferation-activated receptors，PPARs）屬于配

4、體激活性核激素受體超家族，存在三個(gè)亞型：PPARα、PPARβ（或PPARδ）和PPARγ1-3]。研究發(fā)現(xiàn)人胎盤PPARs三個(gè)亞型均有表達(dá)，并參與滋養(yǎng)層細(xì)胞分化、胚胎植入、脂質(zhì)和葡萄糖代謝及血管發(fā)生等過程，與胎盤胎兒的發(fā)育密切相關(guān)[11]。但關(guān)于各種配體激活PPARs后，通過調(diào)控哪些因素而參與胎盤胎兒發(fā)育過程并不清楚。
　　 PPARs的天然配體主要來源于飲食和機(jī)體的代謝產(chǎn)物[12]，研究表明限制動(dòng)物蛋白攝入量或孕期營養(yǎng)不良可

5、使胎盤11β-HSD2表達(dá)減少[13]或活性降低[14]，但具體機(jī)制尚不清楚。因此課題的第一部分利用原代培養(yǎng)的人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，研究不同PPARs對(duì)11β-HSD2表達(dá)和活性是否有調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制；收集正常和PIH孕婦所分娩的胎盤組織，檢測(cè)PPARs三個(gè)亞型和11β-HSD2 mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 硫化氫（hydrogen sulphide，H2S）是人類發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號(hào)分子，在機(jī)體心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)生理活動(dòng)及

6、病理改變中發(fā)揮重要作用[15]。研究表明人類胎盤組織表達(dá)H2S合成酶——CBS和CSE，并可生成H2S[16]，但關(guān)于它們的具有功能及其調(diào)節(jié)并不清楚。胎盤作為妊娠期所特有的器官，也是體內(nèi)最大的內(nèi)分泌器官之一，可合成、分泌多種激素及其代謝酶、細(xì)胞因子等。其中胎盤合成和分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin-releasing hormone, CRH）不僅影響胎兒的發(fā)育與成熟、參與分娩啟動(dòng)，且與早產(chǎn)、IUGR、PIH等

7、疾病有關(guān)[17-19]。研究證實(shí)氣體信號(hào)分子在CRH表達(dá)的調(diào)節(jié)中起著重要作用，如NO、CO、H2S均可抑制下丘腦釋放CRH，NO抑制胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞CRH的釋放[20,21]。因此本課題第二部分，利用免疫組化方法觀察H2S合成酶在胎盤組織中的表達(dá)定位；利用原代培養(yǎng)的人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，檢測(cè)H2S是否影響CRH mRNA、多肽的合成及其分泌；研究PPARs是否影響H2S合成酶的表達(dá)和CRHmRNA、多肽的合成及其分泌；收集正常和PIH孕婦所分

8、娩的胎盤組織，檢測(cè)H2S合成酶的表達(dá)和H2S的生成。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 第一部分不同亞型PPARs對(duì)胎盤11β-HSD2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制：
　　 1、定量PCR、western 印跡雜交和放射酶活性測(cè)定結(jié)果顯示PPARα特異性激動(dòng)劑GW7647呈劑量依賴性方式抑制11β-HSD2 mRNA和蛋白表達(dá)及其氧化酶活性，PPARγ特異性激動(dòng)劑羅格列酮?jiǎng)t作用相反——呈促進(jìn)效應(yīng)，二者均在10-6M 達(dá)到最大

9、作用。上述作用可分別被PPARα特異性拮抗劑GW6471和PPARγ特異性拮抗劑GW9662 逆轉(zhuǎn)，說明PPARs不同亞型對(duì)胎盤11β-HSD2表達(dá)和活性具有不同的調(diào)節(jié)作用；
　　 2、蛋白合成抑制劑CHX不影響GW7647和羅格列酮對(duì)11β-HSD2的調(diào)節(jié)作用，提示上述PPARs對(duì)11β-HSD2 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用不是通過影響其他蛋白的表達(dá)的間接作用，而是直接作用于11β-HSD2；
　　 3、RXRs 配體9-

10、順-維甲酸單獨(dú)作用可上調(diào)胎盤11β-HSD2 mRNA和蛋白表達(dá)，且對(duì)羅格列酮上調(diào)胎盤11β-HSD2表達(dá)的作用有增強(qiáng)的趨勢(shì)；利用RXRasiRNA 干擾胎盤RXRα表達(dá)后，可逆轉(zhuǎn)羅格列酮調(diào)節(jié)胎盤11β-HSD2表達(dá)的效應(yīng)。以上說明PPARγ對(duì)胎盤11β-HSD2的調(diào)節(jié)作用可能是通過和RXRα形成異源二聚體這個(gè)經(jīng)典途徑實(shí)現(xiàn)的。9-順-維甲酸對(duì)GW7647下調(diào)11β-HSD2表達(dá)的作用沒有影響，且干擾胎盤RXRα表達(dá)后，PPARα的調(diào)節(jié)效

11、應(yīng)依然存在，提示RXRα不參與PPARα對(duì)胎盤11β-HSD2的調(diào)節(jié)過程；
　　 4、mRNA 合成抑制劑5，6-二氯-1-β-D 呋喃核糖苯并咪唑（5,6-dichlorobenzimidazole1-β-D-ribfuranoside, DRB）不影響GW7647和羅格列酮對(duì)11β-HSD2的調(diào)節(jié)作用，說明上述PPARs對(duì)11β-HSD2 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，不是通過改變11β-HSD2mRNA的穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)的；
　

12、　 5、將含11β-HSD2基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)道基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，結(jié)果顯示GW7647 抑制11β-HSD2的基因轉(zhuǎn)錄，其作用可被GW6471所逆轉(zhuǎn)；羅格列酮?jiǎng)t促進(jìn)11β-HSD2的基因轉(zhuǎn)錄，GW9662 可逆轉(zhuǎn)此上調(diào)作用。以上結(jié)果說明PPARα、PPARγ分別抑制和促進(jìn)胎盤11β-HSD2的基因轉(zhuǎn)錄；
　　 6、收集正常妊娠和PIH患者分娩的胎盤組織，結(jié)果顯示PIH患者胎盤11β-HSD2、PPAR

13、γ mRNA及蛋白表達(dá)較正常者顯著減少，而PPARα和PPARβmRNA和蛋白表達(dá)較正常者顯著增加。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示11β-HSD2與PPARβ之間呈負(fù)相關(guān)、11β-HSD2與PPARγ之間具有正相關(guān)，提示胎盤不同亞型PPARs 參與胎盤11β-HSD2表達(dá)的精細(xì)調(diào)控過程。
　　 第二部分不同亞型PPARs對(duì)胎盤H2S 合成酶表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其意義：
　　 1、免疫組織化學(xué)染色顯示人胎盤組織表達(dá)H2S 合成酶——CBS

14、和CSE，且主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞；
　　 2、利用原代人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，用不同濃度的L-半胱氨酸或/和CSE 抑制劑PAG/CBS抑制劑AOAA、D-半胱氨酸及NaHS 處理細(xì)胞。結(jié)果顯示L-半胱氨酸及NaHS 抑制胎盤細(xì)胞CRH mRNA表達(dá)和多肽水平，PAG 或AOAA 均可逆轉(zhuǎn)L-半胱氨酸的抑制作用，而D-半胱氨酸不影響胎盤細(xì)胞CRH mRNA表達(dá)和多肽含量。以上結(jié)果說明L-半胱氨酸在胎盤H2S 合成酶作用下生成H2S，

15、進(jìn)而抑制胎盤細(xì)胞CRH的合成和分泌。
　　 3、利用原代人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，給予PPARs 各亞型特異性激動(dòng)劑或/和拮抗劑處理。結(jié)果顯示PPAR?特異性激動(dòng)劑GW7647和PPAR?特異性激動(dòng)劑GW0742 抑制CSE、CBS mRNA和蛋白表達(dá)，作用可分別被各自特異性拮抗劑GW6471、GSK0660所逆轉(zhuǎn)；PPAR?特異性激動(dòng)劑羅格列酮促進(jìn)CSE、CBS的表達(dá)，此作用也可為其阻斷劑GW9662 所逆轉(zhuǎn)，說明PPARs不同亞型對(duì)胎

16、盤H2S 合成酶的表達(dá)具有不同的調(diào)節(jié)作用；
　　 4、利用原代人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，用PPARs 各亞型特異性激動(dòng)劑或/和拮抗劑處理細(xì)胞。
　　 結(jié)果顯示GW7647和GW0742 劑量依賴性地促進(jìn)胎盤細(xì)胞CRH mRNA表達(dá)、CRH多肽的合成，而不影響CRH 多肽的分泌量，GW6471、GSK0660可分別逆轉(zhuǎn)上述作用；羅格列酮?jiǎng)t劑量依賴性方式抑制胎盤細(xì)胞CRH mRNA表達(dá)、CRH 多肽的合成和分泌量，GW9662 可逆轉(zhuǎn)

17、此下調(diào)作用。以上結(jié)果提示不同亞型PPARs對(duì)胎盤CRH的表達(dá)和分泌呈不同的調(diào)節(jié)作用。
　　 5、收集正常妊娠和PIH患者胎盤組織，檢測(cè)CBS、CSE mRNA和蛋白的表達(dá)、H2S的生成速率，結(jié)果顯示PIH患者胎盤CBS和CSE mRNA及蛋白表達(dá)、H2S的生成速率等較正常者顯著減少。統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析結(jié)果表明胎盤組織PPAR?表達(dá)與CSE和CBS的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而PPAR?表達(dá)與CSE的表達(dá)呈正相關(guān)，提示胎盤PPARs 可能參與維

18、持胎盤H2S 合成酶表達(dá)的調(diào)節(jié)過程。
　　 結(jié)論：
　　 1、 1）不同PPARs對(duì)11?-HSD2mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用不需要通過合成新蛋白、不影響11?-HSD2 mRNA的穩(wěn)定性，而是直接調(diào)節(jié)11?-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)胎盤11?-HSD2的表達(dá)和酶活性呈現(xiàn)不同甚至相反的調(diào)節(jié)作用；PPAR?可能通過與RXR形成異源二聚體促進(jìn)胎盤11?-HSD2的表達(dá)和活性，而PPAR?對(duì)胎盤11?-HSD2的調(diào)節(jié)過程可能不需要R

19、XR的參與。2）胎盤組織PPAR?與11?-HSD2 之間、PPARγ與11β-HSD2 之間的表達(dá)具有相關(guān)性，提示PPARs 可能參與胎盤11β-HSD2表達(dá)的精細(xì)調(diào)節(jié)過程，即不同PPARs 亞型的表達(dá)水平和活性之間的平衡可能是胎盤維持11β-HSD2 正常范圍的重要影響因素；
　　 2、 1）胎盤表達(dá)CSE和CBS，并能生成H2S；H2S 抑制胎盤細(xì)胞CRH的合成和分泌，提示胎盤局部H2S 可能通過調(diào)控CRH的水平而參與胎盤

20、內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)；2）不同亞型PPARs對(duì)胎盤H2S合成酶CBS、CSE的表達(dá)具有不同甚至相反的調(diào)節(jié)作用；3）PIH患者胎盤與正常妊娠胎盤相比，CBS、CSE mRNA和蛋白表達(dá)、H2S 生成速率均下降，提示H2S在PIH患者的生成減少；胎盤PPARs的表達(dá)與CSE和CBS的表達(dá)具有相關(guān)性，提示不同亞型PPARs 參與胎盤H2S 合成酶正常表達(dá)的調(diào)節(jié)過程；4）不同亞型PPARs對(duì)胎盤CRH 具有不同的調(diào)節(jié)作用，但此作用是PPARs的直接