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1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxin Escherichia coli,ETEC)是引起幼畜腹瀉的主要病原之一,給畜牧業(yè)生產(chǎn)尤其是養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明,K88ac、K99菌毛和ST腸毒素是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌主要的致病因子,它們?cè)谟仔蟾篂a疫苗研制中具有重要的作用。 根據(jù)公布的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxin Escherichia coli,ETEC)的K99菌毛抗原的核苷酸序列(序列號(hào):M3528
2、2)。設(shè)計(jì)特異性引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增得到K99菌毛抗原成熟肽基因,回收純化后將K99基因連于克隆載體pBS-T上,通過(guò)PCR、酶切鑒定、測(cè)序,證明其中含有K99基因片段,命名為pBS-K99。將鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒和原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a用Xhol/Ncol分別雙酶切,通過(guò)T4DNA連接酶將目的基因片段克隆入表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)大腸桿菌中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行蛋白表達(dá),SDS-PAGE、Western blott
3、ing檢測(cè)所表達(dá)的蛋白。 本研究在構(gòu)建重組菌株BL21(DE3)(pET-28a-K99)和BL21(DE3)(pET28a-K88ac-STII)的基礎(chǔ)之上進(jìn)一步作下述研究:采用IPTG誘導(dǎo)法分別對(duì)重組菌株BL21(DE3)(pET28a-K88ac-ST II)和BL21(DE3)(pET-28a-K99)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。SDS-PAGE凝膠電泳分析,重組菌株分別在約30KDa和18KDa處有特異性表達(dá)的蛋白條帶,與預(yù)期分子量
4、大小一致。在表達(dá)蛋白鑒定的基礎(chǔ)之上,通過(guò)透析的方法對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行初步純化回收。重復(fù)跑SDS-PAGE凝膠,切取目標(biāo)蛋白條帶將其裝入特定孔徑大小的透析袋中繼續(xù)水平電泳,使得目標(biāo)蛋白從凝膠中跑出,透析過(guò)夜后用PEG 6000調(diào)整定量蛋白的濃度約為3mg/mL,加入弗氏不完全佐劑作為重組蛋白疫苗。分別以重組蛋白疫苗、商品疫苗和PBS免疫仔豬,優(yōu)化檢測(cè)免疫抗體水平的間接ELISA條件,通過(guò)比較三個(gè)免疫組的抗體水平來(lái)評(píng)價(jià)表達(dá)蛋白作為免疫抗原的有效
5、性。 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組菌株BL21(DE3)(pET-28a-K99)進(jìn)行蛋白表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE分析,結(jié)果表明:所表達(dá)的蛋白表達(dá)產(chǎn)物分子量大小為18KDa,且表達(dá)量較高,表達(dá)蛋白經(jīng)Western blotting檢測(cè)表明:表達(dá)的K99蛋白能和ETEC(C83912)免疫的兔血清發(fā)生特異性結(jié)合,證明其具有反應(yīng)原性。以重組蛋白疫苗、商品疫苗和PBS免疫仔豬,結(jié)果表明:重組蛋白免疫組、商品疫苗免疫組與PBS對(duì)照組抗體水平差異極
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