類風濕關節(jié)炎關聯(lián)基因NLRP1啟動子區(qū)rs878329的功能研究.pdf

1、研究背景：RA是一種以關節(jié)及滑膜組織炎癥為特征的慢性自身免疫性疾病。雖然RA的病因學目前并十分清楚，但是現(xiàn)在已達成共識：RA是由多個基因和未知的環(huán)境誘因相互作用的結果。近期有文獻報道在高加索人群中，nucleotide-binding,leucine-rich repeat pyrin domain containing protein 1（NLRP1）是白癜風以及白癜風相關的自身免疫性疾病的易感基因。此外，至少有兩組獨立的突變位點：一

2、組位于NLRP1的基因內，tagSNP rs6502867；而另一組位于NLRP1的啟動子區(qū)內，tagSNP rs2670660,rs878329, rs7223628, rs8182352, rs4790796, and rs4790797。然而，NLRP1是否也是RA的易感基因目前尚無定論。我們注意到大約25％～30％的廣泛性白癜風病人患有至少一種其他類型的自身免疫性疾病，其中包括RA。由此我們提出假設：在漢族人群中，NRLP1相關

3、的突變位點可能與RA的發(fā)病風險有關。前期的病例對照研究發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)rs878329與RA的發(fā)病具有顯著關聯(lián)性。本文對rs878329 進行了初步的功能研究，借以分析該多態(tài)性位點是否具有功能活性。
　　 研究目的：探討rs878329對NLRP1轉錄的影響以及進一步證實該多態(tài)性位點的生物學功能。
　　 研究方法：提取健康志愿者外周血細胞的基因組DNA，通過TaqMan 探針法進行基因分型，再通過熒光定量PCR在不同基因型的

4、外周血細胞樣本中檢測NLRP1mRNA的表達，分析不同基因型對NLRP1轉錄的影響；將構建好的不同單倍型的重組質粒轉染入HeLa細胞，通過熒光素酶報告基因實驗分析不同單倍型轉錄調控功能是否具有差異；通過EMSA和Supershift 體外分析不同等位的寡核苷酸結合核蛋白的能力。
　　 研究結果：（1）不同基因型健康志愿者NLRP1mRNA表達量存在差異，G/G基因型健康志愿者mRNA 相對表達量顯著高于C/C基因型健康志愿者（P

5、＜0.01，G/C基因型健康志愿者mRNA 相對表達量介于兩者之間；（2）將不同單倍型的DNA 片段克隆至pGL3-Promoter 熒光素酶報告基因質粒，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)對熒光素酶相對活性進行檢測。結果顯示，單倍型G的熒光素酶相對活性顯著高于單倍型C，但是在含有4個copies 片段的重組質粒中，單倍型G和單倍型C的熒光素酶相對活性卻沒有明顯的統(tǒng)計學差異。將不同單倍型重組質粒分別與Runx1真核表達質粒共轉染入HeLa細胞后，過

6、量表達Runx1能顯著抑制單倍型G的熒光素酶相對活性，而對單倍型C 卻沒有抑制作用；（3）生物學分析(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess)預測到G等位所在DNA 序列是轉錄因子Runx1的結合位點。因此，分別合成G和C兩種等位探針進行EMSA 實驗。結果顯示，G等位探針與核蛋白產生一條結合帶，而C等位探針卻不能。通過Supershift分析發(fā)現(xiàn)當加入了抗Runx1抗體后，G等位探針的泳

7、道中出現(xiàn)一條超滯留結合帶，提示G等位探針能夠與Runx1發(fā)生特異性結合。
　　 結論：（1）本研究發(fā)現(xiàn)單倍型G能顯著增強NLRP1轉錄活性，使得 G/G基因型健康志愿者NLRP1mRNA表達的顯著增加。由此推測單倍型G 可能通過上調NLRP1的表達增加了RA的易感性；（2）G等位所在DNA 序列是轉錄因子Runx1的結合位點，增加其結合位點或者過量表達Runx1，均能顯著降低NLRP1轉錄活性，由此推測Runx1是針對G等位的一