RNA干擾對大鯢蛙病毒(CGSRV)主要功能基因表達(dá)與增殖影響的研究.pdf

1、大鯢蛙病毒（Chinese giant salamander Ranavirus，CGSRV）屬于虹彩病毒科、蛙病毒屬，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)殖大鯢的新病原，其感染具有發(fā)病率與死亡率高的特點(diǎn)，給大鯢養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅，其防控技術(shù)已成為人們研究的熱點(diǎn)。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）作為序列特異性的觸發(fā)器，與細(xì)胞內(nèi)同源的m

2、RNA互補(bǔ)配對后再由RNaseⅢ家族中能夠特異性識別雙鏈RNA的Dicer酶切斷，引起生物細(xì)胞內(nèi)同源基因發(fā)生降解而表現(xiàn)出該基因特異性沉默的現(xiàn)象，達(dá)到阻礙病毒基因順利表達(dá)的目的，起到預(yù)防和治療病毒感染的目的。RNA干擾是生物進(jìn)化的結(jié)果，參與多種真核生物功能，包括病毒防御、基因組重排、染色質(zhì)重組、干細(xì)胞的維持、腦的形態(tài)建成以及發(fā)育時(shí)序決定等。
　　本研究通過化學(xué)合成的方法，合成CGSRV病毒主要衣殼蛋白基因(MCP)、甲基轉(zhuǎn)移酶基因(

3、MTase)、DNA多聚酶基因(DNA polymerase)特異的siRNA，把siRNA轉(zhuǎn)染到鯉魚上皮瘤細(xì)胞（Epithelioma Papillosum Cyprini，EPC），再進(jìn)行CGSRV感染。每12h觀察一次細(xì)胞病變（Cytopathogenic effect，CPE），觀察siRNA對病毒增殖情況的影響;應(yīng)用熒光定量PCR(qRT-PCR)以及病毒滴度測定(TCID50)的方法分別對RNA干擾實(shí)驗(yàn)后各基因的相對表達(dá)和病

4、毒量及其毒力進(jìn)行檢測分析，從而研究siRNA對CGSRV的影響，以期為大鯢蛙病毒病的防控提供新的技術(shù)路線。
　　設(shè)計(jì)CGSRV病毒的MCP、MTases、DNA polymerase基因特異的siRNA各3-4條及熒光標(biāo)記的陰性對照(NC-FAM)。使用siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑將不同劑量的NC-FAM轉(zhuǎn)染進(jìn)入EPC細(xì)胞，確定優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染濃度為80 nM，轉(zhuǎn)染體積為200μL;接種的CGSRV病毒為1000倍稀釋后的病毒懸液

5、，接種體積是150μL。通過每12h對干擾后細(xì)胞病變觀察與統(tǒng)計(jì)結(jié)果，確定siR-MCP-3、siR-MCP-4、siR-MT-1、siR-DP-1和siR-DP-2這5個(gè)片段具有更佳的干擾效果，其次是siR-MCP-1、siR-MCP-2、siR-MT-2和siR-DP-3，干擾效果最差的是siR-MT-3。進(jìn)一步運(yùn)用熒光定量PCR法對干擾后病毒MCP、MTases、DNA polymerase基因的相對表達(dá)進(jìn)行檢測分析，分別檢測病毒感

6、染后24h、36h、48h、60h、72h、84h各基因的相對表達(dá)情況，結(jié)果顯示:siRNAs干擾后，在不同的檢測時(shí)間，各基因的相對表達(dá)率都有不同程度的下降，MCP基因的最佳干擾率為75％，MTases基因的最佳干擾率為78％，DNA polymerase基因的最佳干擾率為81％。針對各個(gè)基因干擾效果最佳的siRNA片段分別是siR-MCP-4，siR-MT-1，siR-DP-1。與此同時(shí)，還采用TCID50的方法對干擾后的病毒上清液進(jìn)