水牛結(jié)核病診斷方法的建立與評價.pdf

1、中國擁有豐富的水牛(Bubalus bubalus，Bb)資源，同奶牛一樣受到牛結(jié)核病(Bovine Tuberculosis，bTB)的威脅，而患病牛又是人結(jié)核病的重要傳染源。我國水牛結(jié)核病的控制措施為“檢測撲殺”，所以準(zhǔn)確檢測是有效控制水牛結(jié)核病的關(guān)鍵。水牛結(jié)核病的檢測方法都是沿用奶牛結(jié)核病診斷方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)。因為水牛與奶牛在分類上同為?？频煌瑢俚奈锓N，用于奶牛結(jié)核病的檢測方法在水牛的準(zhǔn)確度較低。因此，本研究旨在評價牛結(jié)核菌素皮內(nèi)

2、變態(tài)反應(yīng)（簡稱皮試法）在水牛上的應(yīng)用。同時，建立水牛結(jié)核病γ-干擾素檢測方法。主要結(jié)果如下:
　　水牛結(jié)核病陽性樣本的建立
　　首先用皮試法與抗體檢測法檢測水牛樣品，確定免疫接種之前所選水牛為陰性，判定標(biāo)準(zhǔn)是兩種方法皆為陰性則判定為陰性;隨后用BCG接種水牛，制造標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本，再于不同時間分別檢測結(jié)核抗體水平與皮試差異值，判定標(biāo)準(zhǔn)是兩種方法中有一種為陽性則判定為轉(zhuǎn)陽。經(jīng)過動物實驗，最終成功得到陰性樣本71頭，接種BCG后，累

3、計轉(zhuǎn)陽45頭。
　　水牛皮試法的標(biāo)準(zhǔn)化
　　利用得到的水牛皮試法檢測結(jié)果與前期奶牛皮試法檢測結(jié)果進(jìn)行比對與分析。首先確認(rèn)水牛與奶牛的皮厚值之間存在明顯差異，隨后確認(rèn)不同品種水牛之間的皮厚值無明顯差異。再通過比較免疫BCG后不同時間的皮試檢測結(jié)果，分析不同時間的皮厚差變化與判定標(biāo)準(zhǔn)的變化，最后將數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，繪制ROC曲線，確定cut-off值為2.495mm。
　　抗水牛IFN-γ單克隆抗體與多克隆抗體的制備
　

4、　利用原核表達(dá)的水牛γ-IFN(BbIFN-γ)免疫小鼠與大耳白兔，制備單克隆抗體與多克隆抗體，經(jīng)過篩選，成功得到6株穩(wěn)定分泌IgM型抗體的單克隆細(xì)胞，命名為:2A9、7C4、9B6、9H2、10E2、10H4。免疫三只大耳白兔，得到3批兔高免血清，制備多克隆抗體后的效價分別為2.56×104、5.12×104、1.02×105，其中3號兔血清效價最高，為1.02×105。
　　綜上所述，本研究成功確定了水牛皮試法的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并制