低強(qiáng)度電磁場影響大鼠糖尿病腎病的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖尿病(Diabetes Mellitus,DM）的發(fā)病率與日俱增，而其伴隨的并發(fā)癥對健康也產(chǎn)生了巨大威脅，例如骨質(zhì)疏松、周圍神經(jīng)病變、糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)等，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球大概有20％-40%的I型或II型糖尿病病人會(huì)發(fā)展成為DN。DN是慢性腎病死亡的首要原因，它大概占到全世界終末期腎病的50%。DN的典型特征是腎小球?qū)Φ鞍踪|(zhì)的通透性增加以及腎小球系膜細(xì)胞（Glomerular Mesangial

2、Cell,GMC）的胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix,ECM）沉積，上述病理改變最終造成腎小球硬化癥以及嚴(yán)重的腎臟損傷。由于腎臟移植手術(shù)的高額費(fèi)用，因而全世界與日俱增的DN發(fā)病率是一個(gè)非常敏感的普遍問題。高血糖及糖代謝紊亂在DN發(fā)生發(fā)展中起重要作用，如果導(dǎo)致腎損傷程度達(dá)到終末期，其可選擇的治療方法非常有限。目前在臨床上，治療DN主要是通過藥物來控制血糖濃度，以及應(yīng)用保護(hù)腎臟的藥物，來達(dá)到聯(lián)合治療的目的。但是，上述藥物對

3、于部分DN患者往往副作用較大、耐藥性差。因而，探求一種既安全又有效的非藥物治療DN的方法配合保護(hù)腎臟的藥物來聯(lián)合治療DN顯得非常必要。
　　低強(qiáng)度電磁場（Low-intensity Electromagnetic Fields,LEMFs）作為一種非侵入式治療手段，有促進(jìn)術(shù)后創(chuàng)傷愈合、減輕組織水腫、消炎止痛等效果。糖尿病本身是一種慢性炎癥的病變，能引起系膜區(qū)ECM中間產(chǎn)物的增加并減緩其降解速度，從而形成 ECM沉積進(jìn)而發(fā)展成為腎小

4、球硬化癥。Norton在1988年就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LEMFs有助于降解體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞和皮膚纖維細(xì)胞ECM成份。因此，如果LEMFs的干預(yù)能有效減少系膜細(xì)胞的ECM合成并提高其降解，將有助于對DN患者腎臟的保護(hù)。有相關(guān)研究報(bào)道了波長為670 nm的低強(qiáng)度的光照（一種極高頻的電磁波）可改善鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的I型糖尿病大鼠的腎臟功能以及抗氧化的能力。俄羅斯學(xué)者曾采用低強(qiáng)度特高頻（300-3000MHz）治療設(shè)備，用于治療小兒血糖代謝紊亂

5、引起的腎損傷，并發(fā)現(xiàn)能緩解損傷程度以及阻止新的類脂聚積引起的漸進(jìn)性壞死的發(fā)生。這些研究雖然能反映出電磁場對糖尿病腎病模型動(dòng)物和患者都有一些積極的作用，但是缺乏系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)探討其可能的機(jī)理，而且這兩個(gè)的實(shí)驗(yàn)均采用高頻電磁場，其產(chǎn)生的熱效應(yīng)也是不可忽視的。除此之外，近幾十年內(nèi)很少有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究能引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。因此，本課題旨在研究LEMFs對于大鼠糖尿病腎病的影響，為防治糖尿病腎病提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。全文主要探討了以下三個(gè)問題：

6、
　?。?）LEMFs的干預(yù)能否影響大鼠DN模型細(xì)胞ECM代謝；
　　（2）三種不同波形LEMFs中哪種波形對ECM合成降解及相關(guān)信號通路影響最大；
　?。?）LEMFs的干預(yù)能否對DN模型大鼠的腎臟起一定保護(hù)作用。
　　第一部分研制一種能輸出任意波形的電磁發(fā)生平臺
　　目的：電磁生物效應(yīng)研究中，最主要的環(huán)節(jié)就是搭建電磁發(fā)生平臺。在長期的研究中，我們基本采用模擬電路搭建平臺，如果需要改變電磁參數(shù)，就需要另外

7、設(shè)計(jì)電磁發(fā)生裝置，使研究周期大大加長，而且本研究中也涉及多種波形參數(shù)。因此，需要研制一款可以輸出任意波形的低強(qiáng)度電磁發(fā)生平臺。
　　方法：采用虛擬儀器技術(shù)、模塊化設(shè)計(jì)、可編程思路編寫數(shù)字信號發(fā)生軟件，實(shí)現(xiàn)了數(shù)字信號輸出，通過D/A采集卡轉(zhuǎn)換成模擬信號，再進(jìn)行功率放大，最后線圈負(fù)載輸出。
　　結(jié)果：該平臺只需要重新編寫軟件的“波形模塊”部分，就能得到需要的參數(shù)，理論上能夠輸出任意波形的LEMFs。
　　結(jié)論：該平臺可方便

8、輸出不同波形并確保其一致性，使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更加科學(xué)，有利于優(yōu)化電磁參數(shù)。
　　第二部分研究不同波形LEMFs對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞株（HBZY-1）ECM代謝的影響
　　目的：LEMFs參數(shù)多樣，無法一一進(jìn)行研究，在初步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們選擇三種在電磁非熱生物效應(yīng)研究中較為常用的波形參數(shù)。如何解決 ECM異常堆積，是目前研究和治療腎小球硬化癥的主要方向，本部分就是研究 LEMFs對DN模型細(xì)胞ECM代謝產(chǎn)物的表達(dá)以及參與調(diào)節(jié)

9、ECM的主要信號通路是否有積極的影響，并找到三種波形中的最優(yōu)參數(shù)。
　　方法：實(shí)驗(yàn)采用1.6mT、15Hz的正弦、方波、脈沖群分別對高糖培養(yǎng)的HBZY-1細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)（8 h/d），連續(xù)3d。完成后采用MTT法檢測細(xì)胞活性，ELISA法檢測上清液中TGFβ1、FN、MMP-2蛋白含量，熒光定量PCR檢測TGFβ1、FN、MMP-2 mRNA含量，Western blot法檢測p38MAPK、ERK、Smad3總蛋白及磷酸化蛋白的

10、表達(dá)。
　　結(jié)果：1、所有高糖組在1d后都表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞活性，與正常組比較具有顯著差異；與高糖對照組進(jìn)行比較，方波和脈沖群組在干預(yù)2d時(shí)開始抑制 HBZY-1細(xì)胞株的增殖，正弦組始終沒有顯著差異；脈沖群組細(xì)胞活性顯著低于方波組。2、所有高糖組的TGFβ1、FN蛋白表達(dá)顯著高于正常組，MMP-2則相反；方波和脈沖群組TGFβ1、FN蛋白表達(dá)顯著低于高糖對照組，而在MMP-2蛋白的表達(dá)上顯著高于高糖對照組，正弦組在這些蛋白表達(dá)上與高

11、糖對照組無顯著差異；脈沖群組在TGFβ1蛋白表達(dá)上顯著低于方波組，而在MMP-2蛋白表達(dá)上則相反，在FN蛋白表達(dá)上則無顯著差異。3、所有高糖組的TGFβ1、FN mRNA表達(dá)顯著高于正常組，MMP-2則相反；方波和脈沖群組TGFβ1、FN mRNA表達(dá)顯著低于高糖對照組，而在MMP-2 mRNA的表達(dá)上顯著高于高糖對照組，正弦組在這些mRNA表達(dá)上與高糖對照組無顯著差異；脈沖群組在TGFβ1、FN mRNA表達(dá)上顯著低于方波組，在MMP

12、-2 mRNA表達(dá)上則相反。4、所有高糖組的磷酸化Smad3蛋白相對表達(dá)量顯著高于正常組；脈沖群組磷酸化Smad3蛋白相對表達(dá)量顯著低于高糖對照組，而方波和正弦組無顯著差異。5、所有高糖組的磷酸化p38MAPK、磷酸化ERK蛋白相對表達(dá)量顯著高于正常組；方波和脈沖群組磷酸化p38MAPK蛋白相對表達(dá)量顯著低于高糖對照組，而正弦組無顯著差異；與方波組相比，脈沖群組磷酸化 p38MAPK蛋白相對表達(dá)量顯著低于方波組；脈沖群組磷酸化 ERK蛋

13、白相對表達(dá)量顯著低于高糖對照組，而方波和正弦組無顯著差異。
　　結(jié)論：方波和脈沖群能有效地抑制高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞的增殖，一方面通過抑制系膜細(xì)胞TGFβ1、FN的合成減少ECM的沉積，另一方面通過促進(jìn)MMP-2的合成加速ECM降解。此外，方波和脈沖群還通過抑制TGFβ1/Smad3、MAPK信號通路減少系膜細(xì)胞的損傷。脈沖群對系膜細(xì)胞的作用效果顯著好于方波。
　　第三部分研究PEMFs對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠DN的影響

14、。
　　目的：用體外研究得到的最優(yōu)參數(shù)（PEMFs）對I型糖尿病大鼠進(jìn)行干預(yù)，研究在體環(huán)境下PEMFs對DN大鼠腎臟的保護(hù)效果，并驗(yàn)證其對ECM代謝產(chǎn)物以及參與調(diào)節(jié)ECM的通路的影響能否跟體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相印證。
　　方法：將成年SD雄鼠隨機(jī)按體重的匹配分為3組：正常組（非糖尿病大鼠）、模型組（糖尿病模型大鼠）以及脈沖群組（糖尿病模型+PEMFs照射，8 h/d）。干預(yù)6 wks后處死取樣，通過光鏡和電鏡來檢測腎臟的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，

15、qRT-PCR檢測腎皮質(zhì)TGFβ1、FN、MMP-2 mRNA表達(dá)，Western blot法測腎皮質(zhì)TGFβ1、FN、MMP-2、Smad3、p38MAPK、ERK、p-Smad3及p-MAPK蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)過6 wks的PEMFs照射，注射STZ患有DN大鼠的低體重和高血糖癥狀并無緩解。
　　2、PEMFs對于糖尿病大鼠DN病程的發(fā)展，能夠緩解模型大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的病理改變，其表現(xiàn)為與模型組相比光鏡

16、下較輕的腎小球、腎小管--間質(zhì)損傷，以及電鏡下較輕的腎小球基底膜與足細(xì)胞損傷。
　　3、與對照組比較，模型組和脈沖群組腎皮質(zhì)TGFβ1、FN mRNA的表達(dá)顯著高于對照組，而MMP-2 mRNA的表達(dá)則相反；與模型組比較，脈沖群組能顯著抑制腎皮質(zhì)TGFβ1、FN mRNA的表達(dá)，但是顯著促進(jìn)MMP-2 mRNA表達(dá)。
　　4、與對照組比較，模型組和脈沖群組腎皮質(zhì)TGFβ1、FN蛋白的表達(dá)高于對照組，而MMP-2蛋白表達(dá)則相反

17、；與模型組比較，脈沖群組能顯著抑制腎皮質(zhì)TGFβ1、FN蛋白的表達(dá)，但是顯著促進(jìn) MMP-2蛋白表達(dá)。
　　5、模型組和脈沖群組的磷酸化 Smad3、p38MAPK、磷酸化 ERK蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組；脈沖群組磷酸化Smad3、p38MAPK、磷酸化ERK蛋白相對表達(dá)量顯著低于模型組。
　　結(jié)論：通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，組織病理學(xué)結(jié)果證明PEMFs的干預(yù)能緩解DN大鼠腎損傷的病理改變過程，其分子機(jī)制可能是通過抑制TGFβ1

18、/Smad3、MAPK信號通路的作用，從而影響相關(guān)蛋白（TGFβ1、FN、MMP-2）的表達(dá)，進(jìn)而起到緩解DN腎損傷的病理改變的作用，與體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，這也證明了TGFβ1/Smad3、MAPK信號通路是參與DN發(fā)生發(fā)展各種途徑中的重要通路。
　　總結(jié)
　　通過對電磁場非熱生物效應(yīng)的研究積累，我們創(chuàng)新性地提出LEMFs可能通過調(diào)節(jié)ECM代謝緩解DN病程的理論，也是首次系統(tǒng)地通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究了LEMFs對大鼠DN的影響，

19、初步證明了 LEMFs中的方波和脈沖群能夠緩解高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞ECM代謝紊亂，抑制TGFβ1介導(dǎo)的Smad3、MAPK信號通路減輕系膜細(xì)胞損傷，再通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了脈沖群通過調(diào)解 ECM代謝并且抑制TGFβ1介導(dǎo)的Smad3、MAPK信號通路緩解 DN腎損傷程度。我們的實(shí)驗(yàn)研究將LEMFs的修復(fù)損傷、消炎消腫的功效與糖尿病引起的腎損傷結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了LEMFs能夠緩解DN腎損傷程度，并在微觀和宏觀的層面共同揭示了其可能的分子