結核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10參照品的制備及其檢測方法的初步建立.pdf

1、背景：結核病是經呼吸道傳播的慢性傳染病,主要發(fā)生在肺部,是單一致病菌感染導致死亡率最高的世界性重要傳染病?；仡櫺哉{查結果表明,我國結核病的誤診率可達24％,提高結核病的實驗診斷率已刻不容緩。因此,利用簡單、快速、準確的實驗室檢查盡早對結核病做出診斷對控制結核病疫情至關重要。目前結核病診斷的金標準是細菌學檢查,但是涂片和培養(yǎng)的陽性檢出率較低,而且細菌培養(yǎng)也較費時,無法對結核病做出及時的診斷[2]。由于機體受到結核菌感染后,體內首先出現(xiàn)的是

2、結核抗原,因此檢測結核抗原有重要的早期診斷價值,并且結核抗原的檢測可以作為結核桿菌存在的直接證據(jù),且可以避免結核病患者由于免疫應答低下導致的體液免疫檢測或細胞免疫檢測的“假陰性”,因此與檢測結核分枝桿菌抗體相比,檢測特異性抗原更有可能發(fā)展成為結核病早期、快速、特異的新型診斷方法。
　　 最早的結核桿菌抗原是將結核分枝桿菌培養(yǎng)在含有甘油的液體培養(yǎng)基中,經過濾除菌、濃縮制備而成,稱為舊結核菌素。1932年以來,應用蛋白純化手段進一步

3、純化舊結核菌素,所得產物即為結核菌素蛋白衍生物(purified proteinderivation of tuberculin,PPD)。PPD主要用于結核菌素皮膚試驗(tuberculin skintest),由于其抗原成分復雜,大多成分為非結核分枝桿菌和卡介苗(BCG)所共有,因此特異性低,不能區(qū)分感染者和卡介苗接種者,同時對感染后期的開放性結核和全身性結核不敏感。
　　 培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate

4、 protein10,CFP10)是近年來從結核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)的分子量約為10KDa的高度特異性抗原,為人型結核分枝桿菌和牛結核分枝桿菌所特有,卡介苗(BCG)及非致病分枝桿菌缺乏,具有良好的免疫原性,可作為診斷結核病的一個特異性候選抗原[3-4],但通常結核病患者血清或體液(痰、胸腔積液、腦脊液、關節(jié)積液等)中CFP10含量非常低,用ELISA、膠體金免疫層析等方法檢測,難以達到理想的效果。
　　 時間分辨熒光免疫分析

5、技術(time-resolve fluoroimmunoassay,TRFIA)是自80年代以來新發(fā)展起來的一種新型標記分析技術,與其它免疫標記分析技術相比,有其獨特的優(yōu)點。它克服了放射性免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA)中放射性同位素帶來的污染問題；克服了酶免疫分析法(Enzyme immunoassay,EIA)中酶不穩(wěn)定的缺點；而且,由于鑭系元素獨特的熒光特點和TRFIA檢測中采用的波長分辨和時間延遲技術,能夠

6、很好的消除背景熒光的干擾,并可通過解離增強技術,使熒光信號放大百萬倍,使其靈敏度比普通熒光法(Fluoroimmunoassay,FIA)高出幾個數(shù)量級,具有靈敏度高(10-8 mol/孔)操作簡便、易自動化、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、標記物制備簡便且穩(wěn)定、無放射性污染、多標記等特點[5],目前已經成為了一種極具臨床應用潛力的超微量分析技術。
　　 我們通過基因工程技術制備了CFP10的三種重組蛋白,CFP10及鏈親

7、和素標記的CFP10/SA,將重組抗原進行純化、復性、鑒定后,應用時間分辨熒光免疫分析技術,以雙抗體夾心法建立反應模式并優(yōu)化條件。然后分別對CFP10、CFP10/SA在分析靈敏度、穩(wěn)定性方面進行比較,篩選出最優(yōu)的靶標蛋白做為檢測CFP10的參考標準品,并初步建立了時間分辨熒光免疫分析檢測CFP10的方法。
　　 目的：制備CFP10的三種重組蛋白,CFP10及鏈親和素標記的CFP10/SA,從中篩選出合適的靶標蛋白做為檢測CF

8、P10的參考標準品,并初步建立時間分辨熒光免疫分析檢測CFP10的方法。
　　 方法：
　　 1.重組質粒的構建根據(jù)CFP10的基因序列及所選載體的多克隆位點設計引物,以結核分支桿菌標準株H37RV全基因組為模板,加入PCR相關試劑,擴增CFP10片段,并根據(jù)設計的酶切位點與pET21a-SA載體及pET24b、pET24b-SA載體進行酶切后連接,轉化DH5α感受態(tài)細胞,從轉化抗性平板上挑取若干單克隆菌落,進行菌落PC

9、R鑒定及雙酶切鑒定,選擇鑒定成功者送公司雙向測序。
　　 2.重組蛋白的表達,純化將測序正確的質粒轉化大腸桿菌Rosetta,分別挑取3個單克隆菌落接種于3 ml LB標準培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6時,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,分別選用不同溫度和不同的誘導時間進行培養(yǎng),比較不同的實驗條件對重組蛋白表達量的影響,對表達條件進行優(yōu)化。根據(jù)最優(yōu)培養(yǎng)誘導條件,大量擴菌表達,收集菌體,加入裂解液,冰浴超聲裂解

10、細菌,通過SDS-PAGE電泳分析蛋白的表達形式,并對包涵體表達的蛋白以本室發(fā)明的五步洗滌法予以洗滌。將洗滌后包涵體經8M尿素充分溶解后,經鎳金屬螯合層析柱(Ni-NTA)分離純化,對于可溶性表達的重組蛋白則收集破菌后的上清經過濾后直接經親和層析柱純化。
　　 3.重組蛋白的復性及Western blotting鑒定將純化后的變性蛋白濃度調整至0.2 mg/mL,在大于50倍體積的透析液(50mmol/L Tris-HCl,5

11、M尿素,0.5 M L—Arg,0.1％PEG8000,0.5 M EDTA)中,4℃尿素梯度(5M-3M-2M-1M-0M Urea)透析復性,每4h換液一次至0 M尿素,最后用50 mmol/L Tris-Hcl(PH8.0)緩慢透析12-24h,離心收集上清。并在透析過程中觀察透析袋中蛋白的溶解度,是否渾濁或有沉淀形成,復性后蛋白經SDS-PAGE電泳觀察復性效果。
　　 重組蛋白經SDS-PAGE電泳分離后,利用濕電轉法

12、將蛋白轉移至PVDF膜上。0.2％的麗春紅染色,觀察轉移效果,滿意后,用封閉液(5％脫脂奶粉,PBST配制)37℃孵育2h,洗膜,加入封閉液稀釋的小鼠CFP10單克隆抗體,37℃孵育2h,洗膜,加入PBST稀釋的二抗HRP標記的山羊抗小鼠IgG,37℃孵育1h,充分洗膜后,加入DAB試劑顯色,顯色合適時,去離子水終止。
　　 4.時間分辨熒光免疫分析法檢測CFP20參照品的篩選鑒定應用時間分辨熒光免疫分析技術,以雙抗體夾心法對建

13、立反應模式并對包被抗體和標記抗體的濃度進行優(yōu)化。然后分別對CFP10、SA/CFP10在分析靈敏度、穩(wěn)定性等方面進行比較,選擇合適的靶標蛋白做為檢測CFP10的參考標準品,并對參考標準品在線性、精密度及特異性等方面進行分析評價。
　　 結果：
　　 1.重組質粒的構建構建的三個重組質粒經DNA序列測定,測序結果與GeneBank中收錄的SA及CFP10序列進行比對,均完全一致且無讀碼錯誤。
　　 2.重組蛋白的表

14、達、純化將測序正確的質粒轉化大腸桿菌Rosetta,進行誘導表達,收集菌體經超聲波破菌,SDS-PAGE電泳結果顯示SA—CFP10及CFP10-SA分子量均在30KDa左右,與理論值基本相符,表達量分別約占菌體總蛋白25％和30％左右。CFP10分子量在10KDa左右與理論值基本相符,其表達量約占菌體總蛋白35％左右。融合蛋白SA/CFP10主要以包涵體形式存在于破菌后沉淀,而CFP10重組蛋白則以可溶形式存在于破菌后上清中。融合蛋白

15、SA/CFP10洗滌包涵體后,可溶性CFP10重組蛋白過濾后,均經Ni-NTA,His—tag純化,SDS-PAGE電泳結果顯示,三種重組蛋白的純化效果均較好,純度均可達90％以上。
　　 3.重組蛋白的復性及Western blotting鑒定將純化后的融合蛋白CFP10/SA置于透析袋內,于透析液中尿素梯度4℃透析復性,SDS-PAGE電泳結果可看到非還原條帶上有聚體出現(xiàn)(鏈親和素SA本身可形成四聚體)。將可溶性表達的CFP

16、10于2M輕微變性后,以等同于CFP10/SA的復性條件復性。經Western blotting鑒定,三種重組蛋白均可與進口CFP10單克隆抗體發(fā)生特異性反應。
　　 4.時間分辨熒光免疫分析法檢測CFP10參照品的篩選鑒定我們建立了時間分辨熒光雙抗體夾心法,并對包被抗體和標記抗體進行濃度優(yōu)化,以正交試驗確定最優(yōu)條件為:包被抗體濃度為3μg/mL,標記抗體濃度為0.8μg/mL。對自制的CFP10-SA、SA-CFP10及CFP

17、10在分析靈敏度、穩(wěn)定性方面進行了比較,證明CFP10-SA為最優(yōu),其線性范圍為0-80ng/ml,最低檢測濃度可達0.02ng/ml,分別在37℃放置7天,14天,21天,28天,其最大降解率低于8％,為最優(yōu)。通過對其精密度分析,批內的CV<6％,批間的CV<5％,精密度良好。特異性實驗結果證明,CFP10-SA與SA-IL15、SA-GM-CSF、ESAT6、SA-ESAT6、ESAT6-SA均無交叉反應,特異性良好。繪制雙對數(shù)函數(shù)

18、TRFIA標準曲線,其R2=0.9997,相關性良好,而且具有較好的重復性。該參考標準品的成功篩選,及雙抗體夾心法時間分辨熒光免疫分析檢測CFP10方法的初步建立,為進一步研究結核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10時間分辨熒光分析檢測試劑盒及其臨床應用打下了基礎。
　　 結論：
　　 1.成功制備了CFP10-SA、SA-CFP10及CFP10重組蛋白。
　　 2.初步建立了時間分辨熒光免疫分析法檢測CFP10的方法,并篩