高胰島素抑制腎臟尿酸排泄的基礎(chǔ)與臨床研究以及氯沙坦的干預(yù)機(jī)制.pdf

1、研究背景：近年來，代謝綜合征（Me tS）的發(fā)生率在我國逐年增高，因其與心血管疾病、糖尿病和腎臟疾病的發(fā)生率及死亡率密切相關(guān)，目前已成為重要的公共衛(wèi)生健康問題。MetS常伴有較高的高尿酸血癥發(fā)生率，作為MetS基本病理生理特征的高胰島素血癥及/或胰島素抵抗（IR）被認(rèn)為是導(dǎo)致血尿酸水平的升高或高尿酸血癥發(fā)生的主要原因，而腎臟尿酸排泄下降在血尿酸升高中發(fā)揮重要作用。在腎臟中，位于近端腎小管上皮細(xì)胞管腔膜和基底外側(cè)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)尿

2、酸的分子基礎(chǔ)，其中尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(URAT1，SLC22A12基因編碼)在人體中主要負(fù)責(zé)尿酸的重吸收，它在維持血尿酸穩(wěn)定方面扮演重要角色。血尿酸水平的升高或高尿酸血癥既是心血管疾病以及腎臟病發(fā)生的高危因素，還可以導(dǎo)致代謝綜合征相關(guān)組分——肥胖、血脂異常和高血壓等的發(fā)生率增高，甚至可被看作是MetS的組分之一。因此對代謝綜合征患者伴發(fā)無癥狀性的血尿酸升高進(jìn)行干預(yù)是十分必要的，有大量證據(jù)表明，在高尿酸血癥患者中積極控制血尿酸水平對減少心血

3、管事件的發(fā)生、保護(hù)腎臟功能具有非常有益的作用。目前有關(guān)降低血尿酸或促進(jìn)尿酸排泄的藥物因其副作用較大，其臨床應(yīng)用也受到諸多限制。氯沙坦是血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）類降壓藥，人們發(fā)現(xiàn)它除了能有效控制患者血壓、減少心血管并發(fā)癥、減少尿蛋白及保護(hù)腎臟功能外，還可以降低正常人和高血壓患者的血尿酸。總之，高胰島素血癥是否可以促進(jìn)腎臟尿酸排泄、是否經(jīng)胰島素信號通路誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)UR AT1導(dǎo)致血尿酸升高以及具有促進(jìn)尿酸排泄作用的——氯沙

4、坦是否對這一過程有影響，目前作用機(jī)制尚不明確，有必要進(jìn)一步探討。
　　目的：本論文擬從臨床橫斷面分析來觀察MetS患者血胰島素與腎臟尿酸排泄之間的關(guān)系，從體外實驗進(jìn)一步證實高胰島素對 HK-2細(xì)胞 U RA T1表達(dá)及PI3K/Akt1信號通路的影響，并探討氯沙坦對高胰島素誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞URAT1表達(dá)及PI3K/Ak t1信號通路的干預(yù)作用，為MetS伴發(fā)高尿酸血癥的發(fā)生機(jī)制及其防治提供依據(jù)。
　　方法：1.選取2014

5、年3月～2015年3月在我院內(nèi)分泌科就診的MetS患者作為研究對象，進(jìn)行橫斷面觀察。共入選患者108例，其中男性74例，女性34例，平均年齡54.58（55.31±10.68）歲。收集患者基本資料，檢測血液各相關(guān)生化指標(biāo)；測定血清空腹胰島素（FIns）、餐后2h胰島素（2h PIns）。收集患者24小時尿液，計算腎臟對尿酸排泄相關(guān)指標(biāo)：尿酸排泄分?jǐn)?shù)（FEUA，％）、尿酸清除率（CUA，ml/min/1.73 m2）、單位腎小球濾過尿酸排

6、泄（EurGF，mg/dl/1.73 m2）以及尿尿酸/尿肌酐比值（UUA/Ucr）等；根據(jù)中國改良的腎病膳食改良試驗（MDRD）方程估算腎小球濾過率（eGFR）。對不同性別的MetS患者之間一般資料、血和尿生化指標(biāo)以及腎功能相關(guān)指標(biāo)比較；分別將空腹血胰島素、餐后血胰島素、HOMA-IR等變量由小到大按照四分位數(shù)劃分為四組，比較血胰島素和HOMA-IR等指標(biāo)不同組別之間的尿酸排泄各指標(biāo)有無差異；依據(jù)MetS等診斷標(biāo)準(zhǔn)，將患者按照性別、不

7、同年齡組、腰圍、血壓、血糖、血脂、腎小球濾過率、尿蛋白/微量白蛋白、有無糖尿病及高血壓病史等指標(biāo)作為可能的影響因素進(jìn)行單因素分析，比較不同組間MetS患者尿酸排泄指標(biāo)的差異；對 MetS患者尿酸排泄指標(biāo)相關(guān)影響因素進(jìn)行多元回歸分析。2.用不同濃度胰島素刺激人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2），采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測URAT1在HK-2細(xì)胞中的表達(dá)情況，從蛋白和核酸水平深入研

8、究不同濃度胰島素對UR A T1表達(dá)的影響；用高濃度胰島素刺激HK-2細(xì)胞，采用Western Blot法檢測Akt1、p-Akt1以及URAT1蛋白的表達(dá)情況，觀察高濃度胰島素對HK-2細(xì)胞PI3K/Akt1信號通路以及URAT1蛋白表達(dá)的影響。3.用Western Blot法檢測不同濃度氯沙坦（氯沙坦?jié)舛确謩e為1、10、100μM）干預(yù)下高濃度胰島素誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞URAT1蛋白的表達(dá)；用Western Blot法檢測氯沙坦100

9、μM和PI3K/Ak t通路抑制劑LY294002對高濃度胰島素誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞URAT1、Akt1和p-Akt1蛋白的表達(dá)異同。
　　結(jié)果：1.（1）在MetS患者中，男性SUA和Sc r水平較女性高(均為P＜0.001)；（2）血胰島素和 HOMA-IR之間尿酸排泄各指標(biāo)的比較：隨著空腹血胰島素水平的升高，F(xiàn)EUA明顯呈下降趨勢（F=8.920，P=0.004）；隨著餐后血胰島素水平的升高，24hUUA（2h PIns≥22

10、.2 mU/L）、FEUA以及CUA呈明顯下降趨勢（分別為F=7.548，P=0.007；F=9.620，P=0.002；F=15.736，P＜0.001）；HOMA-IR與24hUUA、FEUA、CUA、EurGF和UUA/Ucr的變化趨勢無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（；3）MetS患者尿酸排泄影響因素的單因素分析：男性MetS患者的UUA/Ucr水平低于女性(P=0.002)；非老年組(＜60歲) MetS患者的24hUUA、CUA

11、水平均顯著高于老年組(≥60歲) MetS患者(P＜0.01)；既往有糖尿病史的MetS患者的CUA水平較既往無糖尿病史的MetS患者的高(P＜0.05)，既往有高血壓病史的MetS患者24hUUA、FEUA、CUA、UUA/Ucr等水平均較既往無高血壓病史的MetS患者的低(P＜0.05)；收縮壓升高組(≥130 mmHg)的MetS患者24hUUA水平低于收縮壓正常組(＜130 mmHg)患者(P＜0.05)；根據(jù)BMI及腰圍分組，

12、MetS患者在24hUUA、FEUA、CUA、EurGF、UUA/Ucr上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；PBG升高組(≥7.8 mmol/L)較PBG正常組(＜7.8 mmol/L)24hUUA、CUA水平高(P＜0.05)，根據(jù)FBG、HbAlc分組，MetS患者在24hUUA、FEUA、CUA、EurGF以及 UUA/Ucr上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；TG升高組(TG≥1.7 mmol/L)的24hUUA水平高于TG

13、正常組(TG＜1.7 mmol/L)(P＜0.05)。HDL-C降低組(男<1.0 mmol/L，女<1.3 mmol/L)的24hUUA、EurGF均低于HDL-C正常組(男≥1.0 mmol/L，女≥1.3 mmol/L)(P＜0.05)；eGFR≥90 ml/min/1.73 m2組的MetS患者CUA、UUA/Ucr水平均顯著高于eGFR＜90 ml/min/1.73 m2組MetS患者(P＜0.01)，≥90 ml/min/1

14、.73 m2組的MetS患者EurGF水平顯著低于＜90 ml/min/1.73 m2組MetS患者(P＜0.01)；24 h尿蛋白升高組(24 h尿蛋白≥0.15 g/24h)的MetS患者24hUUA、CUA水平高于24h尿蛋白正常組(24h尿蛋白＜0.15 g/24 h) Me tS患者(P＜0.05)。（4）對MetS患者的血尿酸水平與尿酸排泄指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析結(jié)果顯示：FEUA、CUA、UUA/Ucr這3項指標(biāo)與SUA水平呈負(fù)相

15、關(guān)(P＜0.05)。（5）MetS患者5項尿酸排泄指標(biāo)影響因素的多元回歸分析：年齡和餐后胰島素均與24hUUA呈負(fù)相關(guān)，餐后血糖與24hUUA呈正相關(guān)，在男性患者中，影響24hUUA的主要因素是年齡、HDL-C和餐后胰島素，女性患者中則主要是年齡、尿蛋白以及甘油三酯；餐后血糖與 FEUA呈正相關(guān)，空腹胰島素與 FEUA呈負(fù)相關(guān)，在男性患者中，影響 F EUA的主要因素是空腹胰島素，女性患者中的影響因素則主要是餐后血糖；eGFR、餐后血糖

16、與CUA呈正相關(guān)，餐后胰島素與CUA呈負(fù)相關(guān)，在男性患者中，影響CUA的主要因素是eGFR、餐后胰島素，女性患者中的影響因素則主要是餐后血糖與年齡；eGFR、BMI均與EurGF呈負(fù)相關(guān)；eGFR與UUA/Ucr呈正相關(guān)，既往高血壓病史與UUA/Ucr呈負(fù)相關(guān)，在男性患者中，影響UUA/Ucr的主要因素是eGF R，女性患者中的影響因素則主要是既往高血壓病史與餐后血糖。2.不同濃度胰島素培養(yǎng)HK-2細(xì)胞UR A T1的mRN A和蛋白表

17、達(dá)較空白對照組明顯升高，且隨著干預(yù)時間延長及胰島素濃度的增加而表達(dá)量呈遞增趨勢（均P＜0.05），URAT1 mRNA和蛋白在胰島素100 nM干預(yù)48小時表達(dá)量達(dá)到高峰（分別較對照組升高1.57和1.80倍,均P＜0.05），因此在后續(xù)實驗中均采用此濃度及時間觀察；與對照組比較，高濃度胰島素（100 nM）可以增加p-Akt1蛋白的表達(dá)（P＜0.05），提示胰島素可以活化PI3K/Akt1信號通路；與對照組比較。LY294002可抑制

18、高濃度胰島素誘導(dǎo)的Akt1活化，可顯著減少 p-Akt1的表達(dá)（P＜0.01）；與高濃度胰島素組比較。LY294002可抑制高濃度胰島素誘導(dǎo)的URAT1蛋白表達(dá)（P＜0.05）。3.應(yīng)用不同濃度氯沙坦干預(yù)HK-2細(xì)胞后，URAT1蛋白表達(dá)下降，且隨氯沙坦?jié)舛鹊脑龈撸琔RAT1表達(dá)逐漸下降，與高胰島素組存在明顯差異（P＜0.01）；與正常對照組比較，高濃度胰島素誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)URAT1及p-Akt1表達(dá)明顯增加（P＜0.05），而A

19、k t1的表達(dá)并無明顯差異；與高濃度胰島素組比較，應(yīng)用氯沙坦100μM干預(yù)HK-2細(xì)胞后p-Akt1及URAT1的表達(dá)下降（P＜0.05），應(yīng)用LY294002干預(yù)HK-2細(xì)胞后p-Akt1及URAT1的表達(dá)顯著下降（P＜0.01），且其效應(yīng)較而氯沙坦100μM干預(yù)組更強(qiáng)（P＜0.05），Akt1的表達(dá)并無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：1.血胰島素水平升高是抑制腎小管尿酸排泄而導(dǎo)致血尿酸增高的主要影響因素，在代謝綜合征性高

20、尿酸血癥的發(fā)生機(jī)制中起著非常重要的作用；男性代謝綜合征患者較女性的血尿酸水平明顯增高，腎臟尿酸排泄能力下降可能是導(dǎo)致其血尿酸升高的原因之一，而血胰島素水平升高是它的獨(dú)立影響因素。因此，在代謝綜合征患者中改善高胰島素血癥對于預(yù)防血尿酸升高乃至高尿酸血癥具有積極意義。2.胰島素可通過時間與濃度依賴性的方式誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞URAT1的表達(dá)，胰島素經(jīng)上調(diào) URAT1的表達(dá)來促進(jìn)尿酸在近端腎小管的重吸收，這可能是MetS所致血尿酸升高或高尿酸

21、血癥的發(fā)生機(jī)制之一；高濃度胰島素經(jīng)活化 PI3K/Akt1信號通路而上調(diào)HK-2細(xì)胞URAT1的表達(dá)。3.氯沙坦對高濃度胰島素誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞上調(diào)表達(dá)URA T1有明顯的抑制作用，其抑制作用隨著濃度的增大而增強(qiáng)，呈濃度依賴性；氯沙坦可經(jīng)部分抑制腎小管上皮細(xì)胞PI3K/Akt1信號通路的活性而抑制高胰島素誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞URAT1上調(diào)表達(dá)，從而在伴高胰島素血癥狀態(tài)的MetS所致血尿酸升高或高尿酸血癥中起到抑制腎小管對尿酸的重吸收、促進(jìn)