科羅索酸誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的生物學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 科羅索酸促進(jìn)CaSki宮頸癌上皮細(xì)胞凋亡的作用研究
　　目的：
　　宮頸癌是我國(guó)目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤疾病之一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)表明，宮頸癌已經(jīng)成為了女性惡性腫瘤的第二位，且發(fā)病年齡年輕化、發(fā)病率和死亡率逐年提高，從而嚴(yán)重威脅我國(guó)女性的健康和生命安全。在目前宮頸癌的臨床治療中，通常以化療藥物為主，然而作為化療藥物主體的西藥產(chǎn)生的毒副作用和耐藥性問(wèn)題，嚴(yán)重威脅著患者的臨床預(yù)后和康

2、復(fù)效果。因此，從毒副作用小和耐藥性小的中藥中，篩選抗宮頸癌的藥物成為當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　科羅索酸(C30H48O4)作為一種天然的五環(huán)三萜化合物，來(lái)源于萼獼猴桃（貓人參）、枇杷、大葉紫薇等植物中。在多項(xiàng)臨床和藥理研究中指出，科羅索酸具有抗腫瘤、抗氧化、控制血糖和減肥的功效。在美國(guó)的減肥和糖尿病藥物開(kāi)發(fā)中，科羅索酸已經(jīng)獲得了FDA的Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段。也有多項(xiàng)研究指出，科羅索酸能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的活性、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑

3、制腫瘤內(nèi)的血管新生來(lái)起到很好的抗癌作用。同時(shí)科羅索酸是天然產(chǎn)物，而非人工合成，其生物相容性好，毒副作用和耐藥性低等特點(diǎn)，更突出了其在抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)中的優(yōu)勢(shì)。因而，科羅索酸已經(jīng)成為了抗腫瘤新藥的熱門(mén)候選藥物之一。
　　然而，科羅索酸抗腫瘤的研究多集中在肝癌、胃癌和肺癌中，然而對(duì)于其在宮頸癌上的研究還沒(méi)有系統(tǒng)的報(bào)道。為了明確科羅索酸在宮頸癌治療中的作用和臨床價(jià)值，本文以不同濃度科羅索酸對(duì)人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的凋亡活性的影響為研究

4、目標(biāo)，通過(guò)不同濃度科羅索酸與人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki混合培養(yǎng)，觀察人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、凋亡能力、凋亡率、細(xì)胞周期，小鼠皮下成瘤能力、以及其小鼠皮下成瘤組織中CaSki的增殖能力的變化規(guī)律，從而系統(tǒng)和全面的揭示科羅索酸促進(jìn)人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki凋亡的作用規(guī)律，繼而為宮頸癌的預(yù)防和治療提供新的方法和策略。
　　方法：
　　本研究以科羅索酸對(duì)人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki凋亡活性的影響為突破點(diǎn)，具體實(shí)

5、驗(yàn)方法如下所述。
　　1.應(yīng)用不同濃度的科羅索酸（0、10、50、100μg/mL）與宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki混合培養(yǎng)，觀察宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的形態(tài)變化，從而分析不同濃度的科羅索酸對(duì)CaSki的細(xì)胞形態(tài)影向。
　　2.應(yīng)用MTT法和CCK-8法檢測(cè)不同組別的人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的增殖情況，從而分析不同濃度的科羅索酸(0、10、20、50、100μg/mL)對(duì)CaSki細(xì)胞增殖抑制率的影響。
　　3.應(yīng)用AO

6、/PI染色和Hoechst33258染色檢測(cè)不同組別的人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化，尤其分析不同濃度的科羅索酸對(duì)CaSki細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)變化以及凋亡小體形成的影響;同時(shí)依據(jù)CaSki細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)變化確定凋亡和壞死細(xì)胞，從而計(jì)算不同組別CaSki細(xì)胞的凋亡和壞死率，繼而確定不同濃度的科羅索酸（0、10、50、100μg/mL）對(duì)CaSki細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.應(yīng)用流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析不同組別的人宮頸癌上皮細(xì)胞CaS

7、ki的細(xì)胞周期，從而分析不同濃度的科羅索酸（0、10、50、100μg/mL）對(duì)CaSki細(xì)胞周期的影響，繼而分析CaSki細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的原因。
　　5.應(yīng)用流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析不同組別的人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率，繼而探明不同濃度的科羅索酸（0、10、50、100μg/mL）對(duì)CaSki細(xì)胞凋亡的作用規(guī)律。
　　6.應(yīng)用人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki構(gòu)建小鼠實(shí)體瘤模型，分別應(yīng)用空白組、科羅索酸組（

8、腹腔注射給藥，藥物濃度為10、50、100μg/mL），通過(guò)計(jì)算不同組別腫瘤的相對(duì)體積、重量和小鼠皮下成瘤抑制率，來(lái)研究不同濃度科羅索酸對(duì)CaSki在小鼠皮下成瘤能力的影響。
　　7.應(yīng)用免疫組化檢測(cè)成瘤小鼠的腫瘤組織中CaSki的增殖情況，從而確定不同濃度科羅索酸對(duì)CaSki體內(nèi)生長(zhǎng)能力的影響。從而從動(dòng)物和細(xì)胞水平驗(yàn)證科羅索酸誘導(dǎo)宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki凋亡的作用。
　　結(jié)果：
　　1.科羅索酸能顯著抑制宮頸癌上皮細(xì)

9、胞CaSki的增殖活性，同時(shí)顯微鏡下觀察宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的細(xì)胞形態(tài)可知，隨著對(duì)宮頸癌上皮細(xì)胞添加的科羅索酸濃度的提升宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的細(xì)胞凋亡狀態(tài)的細(xì)胞逐漸增多，凋亡的CaSki細(xì)胞多呈現(xiàn)圓形，并從細(xì)胞團(tuán)中脫落出來(lái)，并懸浮于培養(yǎng)液中，多以1個(gè)或幾個(gè)脆片狀存在，且體積較其他腫瘤細(xì)胞縮小，且細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，出現(xiàn)凋亡趨勢(shì)。
　　2.科羅索酸能促進(jìn)宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的凋亡，應(yīng)用AO/PI染色和Hoechst33258

10、染色可見(jiàn)，科羅索酸能通過(guò)誘導(dǎo)CaSki的細(xì)胞核出現(xiàn)新月形、破碎狀的凋亡小體，同時(shí)也出現(xiàn)細(xì)胞核不規(guī)則移位來(lái)促進(jìn)CaSki的凋亡。
　　3.10、50μg/mL科羅索酸能使得宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的更多停留在G0/G1期，從而降低宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的有絲分裂能力，繼而降低其增殖能力;10、50、100μg/mL科羅索酸能使得宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki在S期占比顯著降低，從而縮短了CaSki在S期內(nèi)進(jìn)行有絲分裂準(zhǔn)備的時(shí)間，從而導(dǎo)致

11、其進(jìn)入G2/M期后遺傳物質(zhì)的缺失，促進(jìn)其凋亡的形成;50、100μg/mL科羅索酸能使得宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki在G2/M期，從而誘導(dǎo)CaSki的凋亡。
　　4.科羅索酸能提升宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率。
　　5.科羅索酸能通過(guò)降低宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki在小鼠皮下成瘤中的腫瘤體積、重量，同時(shí)提升其在小鼠皮下成瘤的抑制率，來(lái)降低宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的在小鼠體內(nèi)成瘤能力。
　　6.科羅

12、索酸能通過(guò)減少腫瘤組織中的有增殖能力的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量和降低其腫瘤組織的腫瘤增殖指數(shù)，來(lái)抑制宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki在腫瘤組織中的增殖活性。
　　結(jié)論：
　　1.科羅索酸能通過(guò)抑制宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的增殖，提高CaSki的凋亡率，使CaSki細(xì)胞的細(xì)胞周期更多停滯在G0/G1期、G2/M期，縮短S期時(shí)間，誘導(dǎo)宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki凋亡。
　　2.科羅索酸對(duì)宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的增殖能力有抑制作用。
　　

13、第二部分 科羅索酸對(duì)CaSki宮頸癌上皮細(xì)胞的PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用研究
　　目的：
　　PI3K-Akt信號(hào)通路，是宮頸癌形成過(guò)程中最為重要的一類(lèi)信號(hào)調(diào)節(jié)通路之一，主要參與宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、浸潤(rùn)、遷移和腫瘤內(nèi)血管新生等諸多病理環(huán)節(jié)，在近代生命醫(yī)學(xué)研究中更是將其作為宮頸癌標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)進(jìn)行研究。國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡已經(jīng)達(dá)成了共識(shí)，認(rèn)為蘇氨酸蛋白激酶AKT的激活必

14、須在PI3K蛋白的催化下，形成AKT磷酸化蛋白(p-AKT)，繼而激活PI3K-AKT-mTOR下游信號(hào)蛋白，來(lái)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和抑制宮頸癌細(xì)胞的凋亡。
　　由此可以推論，科羅索酸誘導(dǎo)宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki凋亡的作用與PI3K-Akt信號(hào)通路密切相關(guān)。為了驗(yàn)證此推論，同時(shí)探索科羅索酸促進(jìn)人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki凋亡的生物學(xué)機(jī)制，本研究擬通過(guò)不同濃度科羅索酸與人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki混合培養(yǎng)，應(yīng)用western blot的

15、方法檢測(cè)人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt表達(dá)量的變化，分析不同濃度科羅索酸對(duì)人宮頸癌上皮細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，從而揭示科羅索酸通過(guò)作用PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)控宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki凋亡的機(jī)理，繼而為進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)宮頸癌治療的天然藥物提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
　　方法：
　　1.配置不同濃度的科羅索酸(0、10、50、100μg/mL)與宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki混合培

16、養(yǎng)。
　　2.應(yīng)用Western Blot檢測(cè)不同組別的人宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表達(dá)量，從而確定科羅索酸通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，來(lái)促進(jìn)宮頸癌上皮細(xì)胞CaSki凋亡的過(guò)程。
　　結(jié)果：
　　1.科羅索酸能抑制CaSki宮頸癌上皮細(xì)胞中PI3K總蛋白的表達(dá);同時(shí)低濃度的科羅索酸能促進(jìn)PI3K蛋白的磷酸化，從而誘導(dǎo)p-PI3K的高表達(dá)，而高濃度的科羅索酸卻能抑制PI3